一 AFLP 分子标记实验
扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism(AFLP 是在随机扩增多 态性 (RAPD 和限制性片段长度多态性 (RFLP 技术上发展起来的 DNA 多态性检测技术, 具有 RFLP 技术高重复性和 RAPD 技术简便快捷的特点, 不需象 RFLP 分析一样必须制备探针, 且与 RAPD 标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征,同时弥补了 RAPD 技术重复性差的缺陷。 同其他以 PCR 为基础的标记技术相比, AFLP 技术能同时检测到 大量的位点和多态性标记。 此技术已经成功地用于遗传多样性研究, 种质资源鉴定方面的研 究,构建遗传图谱等。 其基本原理是:以 PCR(聚合酶链式反应 为基础, 结合了 RFLP 、 RAPD 的分子标记技术。 把 DNA 进行限制性内切酶酶切,然后选择特定的片段进行 PCR 扩增 (在所有的限制性片段
两 端加上带有特定序列的 “ 接头 ” , 用与接头互补的但 3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行 特异 PCR 扩增, 只有那些与 3-端严格配对的片段才能得到扩增 , 再在有高分辨力的测序胶上 分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染染法均可检测之。
一、 实验材料
教师教育研究
二、 实验设备
1. 美国贝克曼库尔特 CEQ8000毛细管电泳系统,
2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机,
GUIPU1
3. 美国 MJ 公司 PCR 仪,
4. 安玛西亚电泳仪等。
三、 实验试剂
1. 试剂:请使用高质量产品,推荐日本东洋坊 TOYOBO 公司的相关产品。
DNA 提取试剂盒;
EcoRI 酶,MseI 酶,T4连接酶试剂盒;
Taq 酶,dNTP, PCR reaction buffer;
琼脂糖电泳试剂:琼脂糖,无毒 GeneFinder 核酸染料替代传统 EB 染料; 超纯水(18.2M Ω ·cm
2.其他实验需要物品
微量移液(一套及相应尺寸 Tip 头,PCR 管,冰浴等。
四、 实验流程
1、 总 DNA 提取
使用 DNA 提取试剂盒提取植物基因组 DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑 胶检测。一般来说, 100ng 的基因组 DNA 作为反应模板是足够的。
2、 EcoR1酶消化 (20ul 体系 /样品
EcoR1 1ul
10×Buffer 2ul 37℃ 65℃ 30min终止反应 sample(总 DNA 5ul
ddH 2O 12ul
3、 Mse1酶消化 (20ul 体系 /样品
人口问题
Mse1 2ul (1U/ul
10×Buffer 2ul
sample(EcoR1酶切产物 80℃ 30min终止反应 ddH 2O 1ul
4、 T4 DNA Ligase(20ul 体系 /样品
T4 DNA Ligase 2ul(1U/ul
10×Buffer 2ul
sample(双酶切产物 10ul队列队形变换
三维建模Mse1 Adaptor 1ul 2265℃ 10min终止反应 EcoR1 Adaptor 1ul
ddH 2O 4ul
5、 预扩增 (20ul 体系 /样品
sample 4ul
Primer(Mse1/EcoR1 1ul
世界经济
AFLP Core Mix 15ul
* AFLP Core Mix 配方:
ddH 2O 13.8ul
MgCl 2 1.6ul
dNTPs(2.5mM 1.6ul
Taq 酶 (1U/ul 1ul
10×Buffer 2ul
预扩增程序:
94℃ 2min
94℃
56℃
72℃ 2min
60℃ 30min
6、选择性扩增 (20ul 体系 /样品
sample 4ul(预扩增产物稀释 20倍 Primer(Mse1-XXX/EcoR1-XXX 1ul
AFLP Core Mix 15ul
选择性扩增程序:
94℃ 2min
94℃ 20s
66℃ 30s 每循环降 1℃,共 10个循环 72℃ 2min
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