生态毒理学报
Asian Journal of Ecotoxicology
第15卷第6期2020年12月
V ol.15,No.6Dec.2020
㊀㊀基金项目：国家重点研发计划 蓝粮仓科技创新 专项 水产病害大数据平台及预警模型构建与应用 课题(2019YFD0900102)；上海市
科委项目(183****1500)
㊀㊀第一作者：周桂娴(1994 )，女，硕士研究生，研究方向为水生动物医学,E -mail:****************㊀㊀*通讯作者(Corresponding author ),E -mail:************
DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20191017001
周桂娴，马荣荣，杨宗英，等.扑草净㊁辛硫磷和亚甲基蓝制剂对凡纳滨对虾的急性毒性及组织病理改变[J].生态毒理学报,2020,15(6):279-289Zhou G X,Ma R R,Yang Z Y ,et al.Acute toxicity of prometryn,phoxim,and methylene blue and their histopathological effects on Penaeus vannamei [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2020,15(6):279-289(in Chinese) 扑草净㊁辛硫磷和亚甲基蓝制剂对凡纳滨对虾的急性毒性及组织病理改变
周桂娴1,2,3，马荣荣4，杨宗英5，胡鲲1,2,3,*
1.上海海洋大学，国家水生动物病原库，上海201306
2.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海201306 3.农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海201306
4.宁波大学，宁波315000
5.南昌市农业科学院，南昌330038
收稿日期:2019-10-17㊀㊀录用日期:2020-02-14
摘要：采用静水生物实验法评价扑草净㊁辛硫磷和亚甲基蓝对凡纳滨对虾(Pemaeus vannamei )的急性毒性风险，为其安全性评估和合理使用提供参考㊂水温28ħ下,3种药物对凡纳滨对虾的24h 半数致死浓度(24h -LC 50)为13.517mg ㊃L -1㊁6.32μg ㊃L -1和5.769mg ㊃L -1;48h -LC 50分别为5.050mg ㊃L -1㊁1.03μg ㊃L -1和4.698mg ㊃L -1，安全浓度为0.211mg ㊃L -1㊁0.0083μg ㊃L -1和
0.935mg ㊃L -1㊂用扑草净㊁辛硫磷和亚甲基蓝48h -LC 50浓度的1/10进行暴露实验，在0㊁2㊁4和6d
取肝胰腺组织和肠道组织做病理切片，得到染毒时间和组织发生病理变化的关系㊂扑草净暴露4d 和6d 后，凡纳滨对虾肝胰腺出现了少量小管结构破坏，管壁细胞缺失，肠道粘膜层的上皮细胞溶解量增多，胞质呈空泡状㊂辛硫磷暴露4d 和6d 后，凡纳滨对虾的肝胰腺组织有肝管排列疏松，管壁不完整，细胞缺失，少量管壁细胞脱落入管腔等现象；肠道组织也出现了大面积溶解，局部可见上皮细胞脱落等不良现象㊂随着亚甲基蓝暴露时间增加，凡纳滨对虾肝胰腺和肠道的组织病变越严重，在暴露4d 和6d 后肝胰腺组织的部分肝管结构破坏，细胞缺失，少量管壁细胞坏死，胞核固缩深染或碎裂溶解；肠道组织在暴露6d 后，黏膜层上皮完全丧失，肠腔内可见少量脱落的上皮细胞㊂
关键词：扑草净；辛硫磷；亚甲基蓝；凡纳滨对虾；急性毒性；组织病理变化文章编号:1673-5897(2020)6-279-11㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:A
Acute Toxicity of Prometryn ,Phoxim ,and Methylene Blue and Their Histopathological Effects on Penaeus vannamei
Zhou Guixian 1,2,3,Ma Rongrong 4,Yang Zongying 5,Hu Kun 1,2,3,*
1.National Pathogen Collection Center for Aquatic Animals,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China
中国麻风皮肤病杂志
2.National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China
3.Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources,Ministry of Agriculture,Shanghai 201306,China
4.Ningbo University,Ningbo 315000,China
280
㊀生态毒理学报第15卷
5.Nanchang Academy of Agricultural Sciences,Nanchang330038,China
Received17October2019㊀㊀accepted14February2020
Abstract:The acute toxicity risk of three chemicals(prometryn,phoxim,and methylene blue)on Penaeus van-namei was evaluated using hydrostatic biological method.At the temperature of28ħ,the24h median lethal con-
centration(24h-LC
50)of prometryn,phoxim,and methylene blue was13.517mg㊃L-1,6.32μg㊃L-1and5.769mg
㊃L-1,respectively.And the48h-LC50was5.050mg㊃L-1,1.03μg㊃L-1and4.698mg㊃L-1,respectively.Meanwhile, the safe concentrations of prometryn,phoxim,and methylene blue were0.211mg㊃L-1,0.0083μg㊃L-1,and0.935 mg㊃L-1,respectively.Exposure experiments were conducted with the chemical concentration of10%LC50at48h. Hepatopancreas and intestinal tissues were taken for pathological sections at0,2,4and6d,and the relationship be-tween the time of infection and pathological changes in tissues was obtained.After4d and6d of prometryn expo-sure,a small number of tubular structures were destroyed in the hepatopancreas of Penaeus vannamei,and the wall cells were missing.At the same time,the dissolved amount of epithelial cells in the intestinal mucosa was in-creased,and the cytoplasm was vacuole.After exposure to phoxim for4d and6d,the hepatopancreas of Penaeus vannamei showed loose arrangement of hepatic ducts,incomplete wall,loss of cells,and a small number of wall cells shed into the lumen.Intestinal tissue also showed a large area of dissolution,local epithelial cell shedding and other adverse phenomena.With the increase of exposure time of methylene blue,tissue lesions were more serious in hepatopancreas and intestinal tract of Penaeus vannamei.At4d and6d after exposure,some hepatic duct struc-tures in hepatopancreas were damaged,cells were lost,a small number of wall cells were necrotic,and nucl
ei were hyperchromatic or fragmented and dissolved.After6d of exposure,the mucosa epithelium was completely lost, and a small number of epithelial cells were shed in the intestinal lumen.
Keywords:prometryn;phoxim;methylene blue;Penaeus vannamei;acute toxicity;histopathologic change
㊀㊀扑草净是一种常见的三氯苯类除草剂，稳定性很强，易溶于有机溶剂，可用来去除阔叶草[1]㊂扑草净的半衰期较长，土壤中为12~18个月，地下水中达88d，光照条件下河水中是263d[2]㊂山东莱州湾近海水域中扑草净的残留浓度达到21.2mg㊃L-1[3]㊂李如茵等[4]研究发现，近年来因具有清除水体中丝状藻类和水草的功能，扑草净也被频繁用于水产养殖中，导致水产品中的扑草净残留严重，极大影响了消费者的健康㊂
辛硫磷是一种常见的有机磷类杀虫剂，因具有高效㊁低毒等优点被用于农作物虫害防治㊂辛硫磷被胆碱酯酶代谢后抑制胆碱酯酶的活性，导致乙酰胆碱在突触内聚集，引起生物神经功能紊乱，从而引发中毒症状[5]㊂近些年来，辛硫磷不仅用于稻虾立体种养模式中农作物防虫，而且用于水产养殖中防治鱼类寄生虫病害[6]以及鱼类败血症[5]㊂辛硫磷对不同水产动物的安全浓度差异比较大，对虹鳟幼鱼的96h安全浓度是0.407μg㊃L-1，属于剧毒药物[7]㊂用辛硫磷杀虫风险高[8]，因为它能够极大地影响罗非鱼的成活率㊂实验结果显示，辛硫磷对斑马鱼是一种高毒药物[5]㊂辛硫磷对凡纳滨对虾养殖的安全性没有相关的研究报道㊂
亚甲基蓝又名次甲基蓝，是一种噻嗪类的染料，近些年来作为孔雀石绿的替代品在水产养殖中经常使用，可以有效控制和治愈鱼类的疾病(如烂鳃病和烂皮病等)[9]㊂亚甲基蓝是潜在的高风险化合物，美国和日本等都不允许使用，尽管亚甲基蓝的毒性与孔雀石绿相比并不强，但仍然有可能对人类健康带来影响[10]㊂
凡纳滨对虾是我国普遍养殖的优良对虾品种之一，具有广盐度养殖㊁产量较高㊁养殖周期较短和肉质鲜美等优点㊂近年来随着对虾病害频繁发生㊁养殖水域环境的恶化㊁稻虾养殖模式的兴起，一些化学品如扑草净㊁辛硫磷和亚甲基蓝等在凡纳滨对虾养殖中被使用并后续在环境中被检出㊂虽然，这些化学品属于杀虫剂㊁消毒剂和除草剂，在水产养殖过程中也会被使用㊂在凡纳滨对虾养殖过程中，扑草净可以有效去除青苔及水草对养殖水体的影响，辛硫磷被用来防治对虾寄生虫，亚甲基蓝被用来凡纳滨对虾的纤毛虫和黑鳃病，但扑草净㊁辛硫磷和亚
第6期周桂娴等：扑草净㊁辛硫磷和亚甲基蓝制剂对凡纳滨对虾的急性毒性及组织病理改变281
㊀
甲基蓝对凡纳滨对虾的安全性方面却没有相关的研
究报道㊂
本文以凡纳滨对虾幼虾为实验材料，得到了扑草净㊁辛硫磷和亚甲基蓝对凡纳滨对虾的48h半数致死浓度(48h-LC
50
)及安全浓度，并分析了随着时间延长3种药物对凡纳滨对虾的肝胰腺㊁肠道组织的影响，旨在探究3种药物对凡纳滨对虾的急性毒性，为3种药物在凡纳滨对虾养殖中合理使用和安全性评估提供参考㊂
1㊀材料与方法(Materials and methods)
1.1㊀实验材料
1.1.1㊀受试动物
实验所用凡纳滨对虾由上海农沧水产养殖公司提供，选择无病㊁规格均匀且活力较好的幼虾进行本次实验㊂平均体长(6.0ʃ1)cm，平均体重(3.0+1)g，暂养后选取400尾进行实验㊂
1.1.2㊀实验方法
实验在室内进行，使用的水是由充分曝气无余氯残留的自来水和过滤消毒后的近海海水混合组成㊂将
幼虾放入500L塑料桶中暂养，用充气泵24 h连续打氧㊂将养殖水体水温稳定在(25ʃ1)ħ,pH 8.5ʃ0.5，溶解氧浓度>6.0mg㊃L-1，盐度3ɢ㊂每日3次按照对虾总体重5%投喂配合饲料，暂养7d㊂为防止水质污染，每日定时吸取桶底残饵粪便并换水10%，驯养期间死亡率不超过5%㊂实验前1d停止投喂，对幼虾进行扑草净等3种化学品的急性毒性实验㊂急性毒性实验开始时，使用容积为20L的塑料桶，实验水体为10L，桶内放入连接打氧泵的气泡头以保证溶氧㊂为防止受试动物从桶中跳出，使用40目软尼龙网覆盖在桶面㊂在试验期间，每隔
24h换试验液一次㊂在用10%48h-LC
50
药物浓度处理对虾后，分别在0㊁2㊁4和6d分离对虾肝胰腺及肠道做组织切片时，实验养殖容器为50L的塑料桶，每桶50尾对虾㊂
1.1.3㊀供试试剂
扑草净：浙江中山化工集团股份有限公司生产，有效成分含量为40%的可湿性粉剂，产品标准号为GB23553 2009㊂辛硫磷：山东埃森化学有限公司生产，有效成分含量为40%的乳油制剂，产品标准号为GB9557 2008㊂亚甲基蓝：天津市北联精细化学品开发有限公司生产，有效成分含量为98.5%的
标准品㊂饱和：西陇化工股份有限公司，有效成分含量为99.8%㊂甲醛溶液：西陇化工股份有限公司，分析纯㊂乙酸：国药集团化学试剂有限公司,
分析纯㊂
扑草净和辛硫磷采用了符合国标的农药商品制剂，扑草净商品制剂中60%其余成分主要是分散剂SD-8113㊁乙二醇㊁黄原胶和硅酸铝镁等助剂；辛硫磷商品制剂中60%的其他成分主要包含宁乳㊁乙二醇㊁黄原胶㊁有机硅消泡剂和水等，查阅相关文献，鲜有对凡纳滨对虾的毒性研究[11-12]㊂
1.1.4㊀仪器设备
NIKON Eclipse ci显微镜,NIKON digital sight DS-FI2成像系统，日本NIKON公司㊂
1.2㊀LC50的测定
正式实验之前先进行预实验，实验方法参考‘水生生物毒性试验方法“[13]，根据预实验的结果确定正式实验的药物浓度㊂正式实验药物浓度的确定依据预实验结果用对数等间距法在浓度范围中设置5~6个浓度梯度和自然状态下的空白对照组[14]㊂实验采用静水法，每种药物组设置1个空白对照组，每个实验浓度同时设置3个平行，每组10尾虾㊂实验期间定时观察虾体的存活状态㊁活力状态以及是否有中毒症状，及时捞出死亡的幼虾，统计并记录24h和48h的幼虾存活情况㊂将得到的实验数据用Excel201
6进行处理，得到药物浓度-死亡率的线性回归方程，来计算凡纳滨对虾幼虾暴露在药物中
24h和48h的半致死浓度(24h-LC
50
和48h-LC
50
)以及相应的95%置信区间[15]㊂最后采用特伦堡(Tu-rubell)公式计算实验药品的安全浓度(SC)[16],SC=48
h-LC
50ˑ0.3/(24h-LC50/48h-LC50)2㊂
1.3㊀组织切片的制作
在急性毒性实验结束后，出各药物48h-
LC
50，用10%48h-LC50药物浓度处理凡纳滨对虾并同时设置空白对照组㊂在0㊁2㊁4和6d分离对虾肝胰腺和肠道，放入Bouin s溶液固定24h，随后放入浓度为75%的乙醇中保存㊂通过剖取组织，常规取材，脱水，包埋，制片，苏木精-伊红(HE)染后，在光学显微镜下观察并描述，并拍摄对应主要描述中不同种类的病变部位㊂
2㊀结果(Results)
2.1㊀凡纳滨对虾的急性毒性
2.1.1㊀3种药物对凡纳滨对虾的急性毒性
扑草净㊁辛硫磷和亚甲基蓝对凡纳滨对虾的急性毒性结果如表1所示㊂实验期间，所有空白对照组均未发现死亡情况㊂凡纳滨对虾给药前期中毒症
282㊀生态毒理学报第15卷
状主要是出现狂游㊁狂跳㊁不断碰撞箱壁的行为，随着中毒时间的增长对虾渐渐安静㊁运动能力减弱㊁出现侧卧或者直接死亡㊂观察死亡后的对虾状态，可以看出凡纳滨对虾在受到扑草净和亚甲基蓝的毒害死亡之后，虾体呈乳白，头部发黑；辛硫磷中毒死亡的对虾，身体明显发红㊂凡纳滨对虾的死亡率与药物浓度和暴露时间呈正相关㊂相同药物浓度，暴露时间越长，凡纳滨对虾的死亡数量越高；
在同一时间内，药物浓度越高则凡纳滨对虾死亡率也随着上升㊂随着实验时间的延长，低浓度药物组中的幼虾基本与空白对照组的幼虾状态一致，高浓度药物组中的幼虾在实验期间(48h),3种供试药物的毒性随着药物浓度增大和实验时间延长呈现增强的趋势，有显著的剂量和时间效应㊂其中，扑草净㊁辛硫磷的研究结果只针对其商品化的制剂，不排除有联合毒性作用产生的可能㊂
2.1.2㊀3种药物对凡纳滨对虾的半致死浓度㊁安全浓度和回归方程
根据表1中急性毒性的实验结果，经过excel 处理之后可以得到表2中回归方程㊁相关系数(r 2)㊁半致死浓度(LC 50)和安全浓度(SC)㊂扑草净对凡纳滨对虾的24h -LC 50和48h -LC 50为13.517mg ㊃L -1和5.050mg ㊃L -1
，安全浓度为0.211mg ㊃L -1
；辛硫磷对
凡纳滨对虾的24h -LC 50和48h -LC 50为6.32μg ㊃L -1
和1.03μg ㊃L -1
，安全浓度为0.0083μg ㊃L -1
；亚甲基蓝对凡纳滨对虾的24h -LC 50和48h -LC 50为
爱的流刑地5.769mg ㊃L -1和4.698mg ㊃L -1，安全浓度为0.935mg
㊃L -1㊂由表2可知，这3种药物对凡纳滨对虾的毒性为辛硫磷>亚甲基蓝>扑草净㊂
2.2㊀3种药物对虾组织病理学的影响2.2.1㊀扑草净对凡纳滨对虾的组织病理学影响
2.2.1.1㊀肝胰腺组织病理变化
扑草净胁迫凡纳滨对虾0d 的肝胰腺组织结构
恒温器如图1(a)所示，肝胰脏中肝管排列紧密，肝管壁由单层柱状细胞组成，主要为分泌细胞和吸收细胞，分泌
表1㊀3种药物对凡纳滨对虾的急性毒性实验结果
Table 1㊀The acute toxicity test results of three
kinds of chemicals to Penaeus vannamei
光谱表征实验药物Chemicals
浓度/(mg ㊃L -1)Concentration /(mg ㊃L -1)
死亡率/%Death rate/%24h 48h 00020
1030扑草净Prometryn
30305045407067.56090101.3901000005ˑ10-5
10101ˑ10-42030辛硫磷Phoxim
草原生态保护补助奖励机制管理信息系统
5ˑ10-440401ˑ10-340805ˑ10-3
801000000.5
0101.51020亚甲基蓝Methylene blue
4.5202013.5405040.5
80
80
表2㊀3种药物对凡纳滨对虾的半致死浓度(LC 50)和安全浓度(SC )
Table 2㊀The values of median lethal concentration (LC 50)and safe concentration (SC)of three kinds
of chemicals to Penaeus vannamei
药物Chemicals
实验时间/h Test time/h
回归方程Regression equation
相关系数(r 2)Correlation coefficient (r 2)
LC 50/(mg ㊃L -1
)
95%置信区间/(mg ㊃L -1)95%confidence interval/(mg ㊃L -1)SC/(mg ㊃L -1)
扑草净Prometryn 24y =0.9099x -1.67060.988113.517 2.392~76.38648y =0.9942x +12.9570.9068 5.05011.322~17.4970.211辛硫磷Phoxim 24y =14.571x -19.3330.91000.006320.00415~0.0093548y =20.571x -28.6670.95760.001030.000722~0.0014810.0000083
亚甲基蓝Methylene blue
24y =1.9207x +5.63270.9594 5.769 3.332~9.90048
y =1.8013x +11.837
0.9109
4.698 2.536~8.704
0.935
第6期周桂娴等：扑草净㊁辛硫磷和亚甲基蓝制剂对凡纳滨对虾的急性毒性及组织病理改变283
㊀
图1 扑草净胁迫对凡纳滨对虾的肝胰腺组织形态的影响
注:(a)扑草净处理0d 组;(b)扑草净处理2d 组;(c)扑草净处理4d 组，管壁细胞坏死()或缺失();
(d)扑草净处理6d 组，间质内可见较多邻近组织脱落的细胞()偶见炎性细胞浸润()㊂
Fig.1㊀Effect of prometryn stress on hepatopancreas morphology of Penaeus vannamei
Note:(a)0d group of prometryn treatment;(b)2d group of prometryn treatment;(c)4d group of prometryn treatment,and the wall cells were necrotic ()or absent ();(d)6d group of prometryn treatment,and more cells from adjacent tissues were observed in
the interstitium ()and occasionally inflammatory cell infiltration was observed ().
细胞内可见大小不等的液泡，小管间隙有少量结缔组织及毛细血管，组织未见明显异常㊂扑草净处理0d 组(图1(a))和2d 组(图1(b))肝胰脏中肝管排列紧密，肝管壁由单层柱状细胞组成，主要为分泌细胞和吸收细胞，分泌细胞内可见大小不等的液泡，肝小管间隙有少量结缔组织及毛细血管㊂扑草净处理4d 组(图1(c))，肝小管排列紧密，但可以看到管壁细胞坏死，胞核固缩深染，少量小管结构破坏，管壁细胞缺失㊂扑草净处理6d 组(图1(d))，局部肝管排列疏松，间质增宽，间质内可见较多邻近组织脱落的细胞，可见部分炎性细胞浸润㊂
2.2.1.2㊀肠道组织病理变化图2(a)所示，组织中黏膜层上皮细胞排列紧密,
呈柱状，形态正常，上皮细胞内侧可见几丁质层，上皮外侧可见结缔组织层及肌层，组织整体未见明显异常㊂扑草净处理2d 组(图2(b))肠道组织的黏膜层上皮完整，上皮细胞排列紧密，肠腔内可见少量脱落的上皮样细胞，与0d 相比基本无异常；扑草净处理4d 组(图2(c))，黏膜层局部上皮缺失，肠腔内明显可见大量脱落的上皮细胞，较多上皮细胞肿胀，胞质疏松淡染；扑草净处理6d 组(图2(d))，黏膜层大
量上皮细胞脱落入管腔，较多上皮细胞肿胀，胞质呈空泡状㊂
2.2.2㊀辛硫磷对凡纳滨对虾的组织病理学变化2.2.2.1㊀肝胰腺组织病理变化
辛硫磷胁迫凡纳滨对虾0d 的肝胰腺组织结构如图3(a)所示，肝胰腺中肝管排列紧密，肝管壁由单层柱状细胞组成，主要为分泌细胞和吸收细胞，分泌细胞内可见大小不等的液泡，小管间隙有少量结缔组织及毛细血管，组织未见明显异常㊂与辛硫磷处理0d 相比,2d 组(图3(b))肝管排列紧密，少量管壁细胞脱离基底膜，并可见管壁断裂，管壁细胞脱落㊂辛硫磷处理4d 组(图3(c))，肝管排列紧密，少量管壁细胞脱落入管腔，较多管壁上皮细胞脱离基底膜，部分管壁细胞肿胀，胞质疏松淡染㊂辛硫磷处理6d 组(图3(d))，局部肝管排列疏松，间质增宽，少量管壁上皮细胞脱离基底膜，少量管壁不完整，细胞缺失，少量管壁细胞脱落入管腔㊂
2.2.2.2㊀肠道组织病理变化如图4(a)所示，组织中黏膜层上皮细胞排列紧
孙黄田密，呈柱状，形态正常，上皮细胞内侧可见几丁质层，上皮外侧可见结缔组织层及肌层，组织整体未见明
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