新人教版生物学选择性必修3《生物技术与工程》知识梳理 第一节 重组DNA技术的基本工具
基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因 等技术，赋予生物新的遗传特性 ，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品 。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术 。 一、分子手术刀—限制性内切核酸酶
1.全称和简称
全称：_限制性内切核酸酶_
简称：__限制酶_
2.来源：主要是从_原核生物__中分离纯化出来的
3.作用：
①能够识别_双链_DNA分子的某种_特定核苷酸序列 。
②使_每一条_链中_特定部位_的_磷酸二酯键__断开。
4.作用部位：_磷酸二酯键__
5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由_6_个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由_4_个、_8_个或__其他数量_的核苷酸组成。
6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式__黏性末端_和__平末端__。
（1）EcoRⅠ限制酶切割
EcoRⅠ识别序列为GAATTC
EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键
（2）SmaⅠ限制酶切割
SmaⅠ识别序列为CCCGGG
SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键
二、分子缝合针—DNA连接酶
1.功能：将__两个DNA片段连接起来_，恢复被限制酶切开的_磷酸二酯键真空脱蜡炉__。
2.分类和对比
种类 | E·coli DNA连接酶 | T4DNA连接酶 |
来源 | 大肠杆菌 | T4噬菌体 |
特点 | 只缝合 黏性 末端 | 缝合 黏性 末端 平 末端 |
作用 | 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 |
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3．比较与DNA有关的六种酶
名称 | 作用部位 | 作用底物 | 作用结果 |
限制酶 | 磷酸二酯键 | DNA | 将DNA切成两个片段 |
DNA连接酶 | 磷酸二酯键 | DNA片段 | 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 |
DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶 | 磷酸二酯键 | 脱氧核苷酸 | 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 |
DNA(水解)酶 | 磷酸二酯键 | DNA | 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 |
解旋酶 | 碱基对之间的氢键 | DNA | 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 |
RNA聚合酶 | 磷酸二酯键 | 核糖核苷酸 | 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端 |
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三、分子运输车——载体
1.作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
2.种类：质粒、噬菌体 的衍生物、动植物病毒 等。
3.作为载体需具备的条件
①_有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中__；
②_能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制_； ③_常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选_；
④_对受体细胞无害_。
探究.实践：DNA的粗提取与鉴定
1.提取思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在的差异，选用适当的物理或化学方法对他们进行提取。
2.提取原理：
①DNA不溶于酒精 ，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质；
②DNA在不同浓度的NaCl溶液 中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
3.鉴定原理：在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂 会呈现蓝，因此二苯胺试剂 可以作为鉴定DNA的试剂。
4.比较DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
| 溶解规律 | 2 mol/L NaCl溶液 | 0.14 mol/L NaCl溶液 |
DNA | | 溶解 | 析出 |
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5．DNA粗提取中的注意事项
（1）本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞 无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
（2）加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精 和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀 墙上画大饼。坦克巷战
（3）二苯胺试剂要现配现用 ，否则会影响鉴定的效果。
（4）提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜 ，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。 （5）在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精 的作用是溶解杂质和析出DNA。
第二节 基因工程的基本操作程序
一、目的基因的筛选与获取
（一）目的基因的筛选与获取
1.目的基因概念
在基因工程的设计和操作中，用于__改变受体细胞性状__或__获得预期表达产物_等的基因就是目的基因（根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指__编码蛋白质的基因___）。
2.筛选目的基因的方法
（1）从相关的__已知结构__和__功能清晰__的基因中进行筛选。
（2）获取方法
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR的概：PCR是__聚合酶链式反应__的缩写，是一项根据_DNA半保留复制_的原理，在_体外_提供参与DNA复制的__各种组分__与_反应条件thinkcentre m4350q_，对_adc发泡剂目的基因的核苷酸序
列_进行__大量复制__的技术。
①全称：__聚合酶链式反应___
②原理：___DNA半保留复制___
③操作环境：__体外（PCR扩增仪/PCR仪）___
④目的：__对目的基因的核苷酸序列进行大量复制___
⑤优点：___可以在短时间内大量扩增目的基因___
（2）DNA体内复制的条件
参与的组分 | 在DNA复制中的作用 |
DNA母链 | 提供DNA复制的模板 |
4种脱氧核苷酸 | 合成DNA子链的原料 |
解旋酶 | 打开DNA双链 |
DNA聚合酶 | 催化合成DNA子链 |
引物 | 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 |
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注：引物是一小段能与_DNA母链__的一段碱基序列__互补配对_的_短单链核酸__。
（3）DNA体外复制（PCR）的条件
淄博乐通塑料建材有限公司参与的组分 | 在DNA复制中的作用 |
DNA母链 | 提供DNA复制的模板 |
4种脱氧核苷酸 | 合成DNA子链的原料 |
引物 | 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 |
90℃以上高温 | 打开DNA双链（变性温度） |
耐高温的DNA聚合酶 | 催化合成DNA子链 |
缓冲液（含Mg2+ ) | 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 |
其他不同的温度 | 变性、复性和延伸 需要不同温度 |
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注：复制的原料实为dNTP （dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同时水解产生能量为合成DNA子链提供能量，因此体系中不需要添加ATP 。
（4）过程
目的基因DNA__受热变性__后_解为单链_，_引物 与单链相应_互补序列_结合；然后以__单链DNA__为模板在_DNA聚合酶_作用下进行_延伸__，即将4种_脱氧核苷酸__加到__引物的3’__，如此__重复循环多次__， 每次循环一般可以分为_变性、复性和延伸_三步。
注：
变性 | 温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链 | |
复性 | 温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 | |
延伸 | 温度上升到72 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸 | |
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拓展：DNA复制的相关计算
1.子代DNA分子总数： _2n_ 个；
2.第n代产生的DNA数：_2n-1_个；
3.子代DNA脱氧核苷酸链总数= _2n+1_ 条
4.第n代产生的DNA链数：_2n_条
①n代后，DNA分子有_2n_个
②n代后，DNA链有_2n+1_条
③第____代出现完整的目的基因
④n代后，含引物的DNA分子有_2n__个
⑤n代后，共消耗_2n+1-2_个引物
⑥第n代复制，消耗了_2n_个引物
⑦n代后，完整的目的基因有_2n-2n_个
4.获取目的基因的其他方法
（1）构建基因文库来获取目的基因：将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
①基因组文库：包含一种生物所有的基因。
②部分基因文库：只包含一种生物一部分基因，如cDNA文库。
（2）利用化学方法人工合成：用DNA合成仪，要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知，不需要模板。
（二）基因表达载体的构建（核心）
1.基因表达载体的组成
基因表达载体必须包括_目的基因_、__标记基因_、_启动子_、_终止子_等（若需要能完成自主复制，还应有_复制原点_）。
（1）启动子
①本质：一段有特殊序列结构的_DNA_片段。
②位置：位于基因的_上游_，紧挨__转录的起始位点__。
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