广东药科大学学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University
Jan.2021,37(1)
收稿日期:2020‐12‐02
基金项目：国家自然基金青年科学基金资助项目（81503260）；广东省中医药局科研项目（20202105）作者简介：陈素雯（1996-），女，在读硕士，研究方向为中药制剂研究与开发，Email:*****************通信作者：吴燕红（1969-），女，高级工程师，主要从事中药新药研究与开发，Email ：*****************。ct系统参数标定
陈素雯1，魏嘉宝2，邱思娃1，李苑新1，蔡延渠1，吴燕红1
（1.广东药科大学新药研发中心，广东广州510006；2.高州中医院药学部，广东高州525200）
摘要：目的探讨龙脷叶水提取物对哮喘模型大鼠肺组织病理学及血清中IL‐5、TXB2和6‐Keto‐PGF1α的
影响。方法先采用腹腔注射卵清白蛋白（OVA ）与氢氧化铝致敏、后雾化吸入OVA 激发复制大鼠哮喘模型，通过HE 染观察大鼠肺组织病理改变，ELISA 法检测血清IL‐5、TXB2和6‐Keto‐PGF1α浓度水平。结果与正常组比较，模型组支气管、血管周围和肺泡组织内炎性细胞可见明显增多，在血管周围浸润成环形成血管套袖，呈现明显哮喘病理改变；组各部位炎性细胞明显减少，血管周围“套袖”样炎性浸润明显减少或消失，炎性病理改变明显减轻。与模型组比较，组大鼠血清中IL‐5、TXB2浓度水平明显降低（P<0.01），6‐Keto‐PGF1α浓度明显升高（P<0.01），TXB2/6‐Keto‐PGF1α比值降低（P<0.05）。结论龙脷叶水提取物可以减轻哮喘模型大鼠肺组织与支气管炎性病理改变，推断可能是通过降低炎性因子IL‐5、TXB2/6‐Keto‐PGF1α浓度水平从而减轻炎症。关键词：龙脷叶；哮喘；肺组织；病理；炎症因子 中图分类号：R285.5文献标识码：A 文章编号：2096‐3653(2021)01‐0055‐06DOI:10.16809/j/cnki.2096‐3653.2020120201
Effect of water extract from Sauropus spatulifolius on lung histopathology and inflam⁃matory factors in asthmatic rats
CHEN Suwen 1,WEI Jiabao 2,QIU Siwa 1,LI Yuanxin 1,CAI Yuanqu 1,WU Yanhong 1*(1.New Drug Research and Development Center,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;2.Department of Pharmacy,Gaozhou Traditional Chinese Medicine Hospital,Gaozhou
525200,China )
*
Corresponding author Email:*****************
Abstract:Objective To explore the effect of water extract from Sauropus spatulifolius on lung histopa‐
thology and inflammatory factors IL‐5,TXB2and 6‐Keto‐PGF1αin asthmatic rats.Methods The rat asthmatic model was induced by intraperitoneal injection of ovalbumin (OVA)and aluminum hydroxide,
and then aerosol inhalation of OVA.The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining.The serum levels of IL‐5,TXB2and 6‐Keto‐PGF1were detected by ELISA.Results Compared with the normal group,the inflammatory cells in the bronchi,perivascular and alveolar tissues of the model group significantly increased,and infiltrated into rings around the blood vessels to form vascular sleeves,showing obvious pathological changes of asthma.In the treatment group,the inflammatory cells in
all parts were obviously reduced,the sleeves‐like inflammatory infiltration around blood vessels was
obviously reduced or disappeared,and the inflammatory pathological changes were obviously alleviated.Compared with the model group,the levels of IL‐5,TXB2and the ratio of TXB2/6‐Keto‐PGF1αwere significantly reduced in the treatment group,but the levels of 6‐Keto‐PGF1αwere markedly increased (P<0.05).Conclusion The water extract of Sauropus spatulifolius can alleviate the inflammatory
广东药科大学学报第37卷pathological changes of lung tissue in asthmatic rats,which may be due to the modulation of inflammatory
factors IL‐5,TXB2and6‐Keto‐PGF1α.
Key words:Sauropus spatulifolius;asthma;lung tissue;pathology;inflammatory cytokines
龙脷叶是岭南民间传统常用止咳平喘中药，始载于《岭南采药录》，其中所记载的龙脷叶“治痰火咳嗽，以其叶煮猪肉汤食之”[1]。临床上龙脷叶常用于“支气管炎、支气管哮喘、咳嗽”等呼吸道疾病[2-3]，近年来，对龙脷叶的药理研究报道主要涉及抗炎及止咳作用，对平喘作用的研究较少。本研究采用大鼠哮喘模型，观察龙脷叶水提取物对哮喘大鼠支气管及肺组织的病理学及血清中IL‐5、
TXB2和6‐Keto‐PGF1α的影响，初步探讨龙利叶平喘的作用机制。
1材料
1.1实验动物
SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量140~ 160g，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号: SCXK（粤）2018‐0002，饲养于广东药科大学实验动物中心，使用许可证号:SYXK（粤）2017‐0125。
1.2药物
龙脷叶水提取物制备：龙脷叶（批号180801，符合2015年版《中国药典》标准，广东时珍制药有限公司），剪碎，大小约为2cm×2cm，加10倍量水煎煮1h，煎煮2次，医用棉花过滤，合并滤液，浓缩至每毫升相当于生药量1g（1g/mL）。地塞米松注射液（2mg/mL，批号1704292，江苏涟水制药有限公司）; 0.9%NaCl注射液（批号H18060814，山东华鲁制药有限公司）；乌拉坦（批号Z30S9Y71673，上海源叶生物科技有限公司）。
1.3试剂
卵清白蛋白（OVA）（批号1031K051，北京Solar‐bio公司）；氢氧化铝凝胶（批号O1004A，大连美仑生物技术有限公司）;IL‐5和TXB2ELISA试剂盒（批号分别为：L190109529、L181211238，武汉优尔生生命科学装备有限公司）;6‐Keto‐PGF1αELISA试剂盒（批号：TY3CXHLYC6，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）；无水乙醇、二甲苯、盐酸、氨水、中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）；苏木素‐伊红染液（G1005，武汉谷歌生物科技有限公司）。
1.4主要仪器
雾化箱（自制，30cm×19cm×17cm）；WH‐802超声波雾化器（广东粤华医疗器械厂有限公司）；Neo‐fuge15R台式高速冷冻离心机（力康生物医疗科技
控股有限公司）；MX‐F涡旋混合器（武汉塞维尔生物科技有限公司）；DW‐86L626超低温冰箱（青岛海尔生物医疗股份有限公司）；RT3100自动洗板机（雷杜生命科学股份有限公司）；Epoch酶标检测仪（美国伯腾仪器有限公司）；JJ‐12J脱水机（武汉俊杰电子有限公司）；JB‐P5包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB‐L5冻台（武汉俊杰电子有限公司）；KD‐P组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；Nikon
Eclipse CI正置光学显微镜（Nikon Corporation）；Nikon DS‐U3成像系统（Nikon Corporation）。
2方法
2.1实验分组
40只大鼠随机分为正常组（N组）、模型组（Mo 组）、龙脷叶水提取物高剂量组（H组）、龙脷叶水提取物低剂量组（L组）、地塞米松组（De组），每组8只（雌性4只，雄性4只，分组分性别分笼饲养），实验前适应性喂养1周。
2.2哮喘模型建立
参考文献［4‐5］制备大鼠哮喘模型：除正常组外，其余各组于实验第1天腹腔注射含OVA100mg 与100mg氢氧化铝凝胶的生理盐水混悬液1mL，致敏大鼠，正常组以生理盐水代替OVA腹腔注射，第15天开始将大鼠置于自制的透明密闭雾化箱，以2%OVA生理盐水溶液最大量超声雾化吸入激发，每次30min，连续激发14d，正常组以生理盐水代替OVA超声雾化吸入。除正常组外大鼠腹腔注射OVA后即出现精神萎靡、拱背蜷缩等表现。在雾化激发后前5~10min出现躁动不安、搔抓鼻子皮毛等症状，10min后活动明显减少、毛发竖立、俯卧不动、伸颈等表现为模型建立成功。
2.3给药方法
旅游资源开发与规划
从第15天起于每次激发前1h灌胃给药，N组与Mo组灌服注射用生理盐水1mL/100g；De组灌服地塞米松注射液0.5mg/kg；根据《中国药典》规定用量9~ 15g，按徐叔云教授主编的《药理实验方法学》中
不同实验动物与人的等效剂量比值来计算实验用药剂量，即H、L组灌服龙脷叶水提取物剂量分别为5.4g/kg与1.35g/kg；每天1次，连续14d。
56
第1期陈素雯，等.
龙脷叶水提取物对哮喘大鼠肺组织病理学及炎症因子的影响
海城黑社会2.4标本采集
2.4.1血清样本采集末次给药雾化吸入OVA 激发
哮喘后24h 内，各组大鼠分别给予20%的乌拉坦生理盐水溶液（剂量0.8g/kg ）腹腔注射麻醉，眼眶内静脉取血3~5mL ，3500r/min 离心15min ，吸取血清，-80℃保存备用。2.4.2肺组织样本采集大鼠取血后迅速剖取肺脏。取左侧肺脏组织固定于4%(φ)多聚甲醛24h 以上。2.5指标检测
2.5.1肺组织病理学观察将固定后的组织逐级酒精脱水、包埋、切片，HE 染法，封片后在光学显微镜下观察支气管与肺组织的病理变化，比较各组大鼠支气管与肺组织病理学变化。
2.5.2血清IL‐5、TXB2和6‐Keto‐PGF1α含量检测将保存于-80℃血清进行解冻处理，按ELISA 试剂盒操作说明进行IL‐5、TXB2和6‐Keto‐PGF1α检测。
2.5.3数据统计与分析应用SPSS18.0统计软件分析，实验数据以均数±标准差（x ±s ）表示。两组样本间比较采用t 检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
3结果
3.1肺组织病理学观察
肺组织HE 染结果显示,N 组：支气管上皮细
胞结构完整，排列紧密（A ），局部可见细支气管(B)管腔内有少量脱落的上皮细胞（黑箭头）及少量嗜酸性黏液分泌（黄箭头）；组织中可见较多肺泡壁轻度增厚，并伴有少量淋巴细胞与中性粒细胞浸润(C)（红箭头）。如图1。
Mo 组：多见支气管管腔内有少量脱落的上皮细
胞(A)（黑箭头）及少量嗜酸性黏液分泌（黄箭头），局部支气管管腔内可见较多红细胞（蓝箭
头）；多见血管周围有较多炎性细胞浸润成环，形成
血管套袖（红箭头）；多见支气管、血管周围与肺泡组织内有较多巨噬细胞浸润(B)（绿箭头），多见肺泡壁增厚，并伴有较多炎性细胞浸润(C)（红箭头）。如图2。
De 组：支气管上皮细胞结构完整，排列紧密
（A ），局部细支气管管腔内有少量嗜酸性黏液分泌（黑箭头），局部管腔内可见少量脱落的上皮细胞（黄箭头）及少量红细胞（蓝箭头）；血管周围“套袖”样炎性浸润消失，多见支气管与血管周围肺泡腔中有较多巨噬细胞浸润（红箭头）；多见肺泡壁增厚，伴有较多淋巴细胞与中性粒细胞浸润（绿箭头）。如图3。
H 组：局部可见支气管管腔内有少量脱落的上
皮细胞（黑箭头）及少量嗜酸性黏液分泌（黄箭
头），局部支气管管腔内可见少量红细胞；血管周围“套袖”样炎性浸润明显减少或消失，局部可见血管或气管周围肺泡腔中有较多巨噬细胞浸润（蓝箭头）；多见肺泡壁增厚，局部有较多炎性细胞浸润（红箭头）。如图4。
L 组：局部可见支气管管腔内有少量脱落的上
皮细胞（黑箭头）及少量嗜酸性黏液分泌（黄箭
头）；血管周围“套袖”样炎性浸润明显减少或消失，局部可见血管或气管周围肺泡腔中有较多巨噬细胞浸润（绿箭头）；组织中可见大量肺泡壁增厚，并伴有较多淋巴细胞与中性粒细胞浸润（红箭头）；局部可见肺泡腔内有少量嗜酸性物质（蓝箭头）。如图5。
观察图1~图5中各实验组的肺组织染结果可知，与N 组相比，M 组支气管管腔内有部分上皮细胞脱落，支气管、血管周围和肺泡组织炎性细胞明显增多，且在血管周围形成明显的“套袖”环，哮喘病变样改变明显，表明实验造模成功。与M 组相比，
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图1正常对照组肺组织染结果(200×)
Figure 1Histopathology of lung tissues in the normal group (200×)
A
B C
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广东药科大学学报第37卷
A
B C
De 、H 、L 组中巨噬细胞等炎性细胞均有明显减少，血管周围“套袖”样炎性浸润明显减少或消失，表明组能有效改善哮喘大鼠的肺组织和支气管病变。3.2大鼠血清中IL‐5、TXB2和6‐Keto‐PGF1α浓度
水平
与正常组比较，模型组IL‐5和TXB2浓度水平
显著升高(P<0.01)，
而6‐Keto‐PGF1α浓度水平显著降低(P<0.01)，TXB2/6‐Keto‐PGF1α比值显著升高(P<0.01)；地塞米松组、龙脷叶水提取物高剂量、低剂量组分别与模型组相比，IL‐5和TXB2浓度水平显著降低(P<0.01)，而6‐Keto‐PGF1α浓度水平显著升高(P<0.01，P<0.05）；TXB2/6‐Keto‐PGF1α比值显著降低(P<0.01)。见表1。
图2哮喘模型组肺组织染结果(200×)
Figure 2Histopathology of lung tissues in the model group (200×)
图3地塞米松组肺组织染结果(200×)
Figure 3Histopathology of lung tissues in the dexamethasone group (200×)
图4龙脷叶高剂量组肺组织染结果（200×）
Figure 4Histopathology of lung tissues in the high dose of Sauropus spatulifolius group (200×)
A
B C
A B C
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第1期陈素雯，等.龙脷叶水提取物对哮喘大鼠肺组织病理学及炎症因子的影响
4讨论
哮喘是呼吸道常见疾病，通常认为哮喘是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞、T 淋巴细胞参与的慢性气道炎症。IL‐5是由活化的Th2细胞产生的细胞因子，可刺激嗜酸性粒细胞生长和分化，主要表现为对嗜酸性粒细胞(EOS)募集、迁移入呼吸道并维持炎症反应具有正向调控作用，嗜酸性粒细胞浸润和IL‐5表达水平增高是哮喘支气管黏膜的特征性改变[6]。研究表明,IL‐5是哮喘炎症中的主要调节因子[7‐8]。
血栓素A2（TXA2）和前列腺素I2（PGI2）的比例失衡在哮喘发病中的作用，已越来越受到国内外学者的关注[9‐10]。TXA2可促使血小板聚集，气道平滑肌收缩，还可促使气道分泌物增多，血管渗透性增高，从而加重气道的炎症反应，而PGI2的作用几乎与TXA2的作用相反。因此，TXA2增高或PGI2下调，致TXA2/PGI2比例失衡或增高引起支气管平滑肌收缩而导致哮喘[11‐13]。TXA2和PGI2在体内水解为活性很小但更稳定的代谢产物TXB2和
6‐ket‐PGF1α，常以TXB2和6‐ket‐PGF1α作为观察TXA2和PGI2活性的标志物。因此，血清TXB2和6‐ket‐PGF1α水平可作为衡量TXA2和PGI2平衡的
标志物[14‐16]。
本实验结果显示龙脷叶提取物能降低哮喘大鼠血清中IL‐5、TXB2浓度水平和TXB2/6‐ket‐PGF1α比值，显著升高6‐keto‐PGF1α浓度水平，提示龙脷叶水提取物可能通过降低炎性细胞浓度水平从而减轻哮喘模型大鼠肺组织与气管的炎性病理改变，促进哮喘大鼠肺功能的恢复。但在组（地塞米松组、龙脷叶提取物高剂量、低剂量组）的病理切片中气管与肺泡组织周围仍可观察到较多的巨噬细胞与炎性细胞，这种情况有待进一步探讨。后续可进行更深入的血清化学研究，结合高效液相法和质谱分析法检测鉴定有效成分，将有助于阐明其发挥哮喘作用的物质基础。
参考文献：
[1]王继华，曹阳，蔡时可.南药龙脷叶的研究进展[J].园艺与种苗,
2018,38(01):59‐62.汕头大学学报
图5龙脷叶低剂量组肺组织染结果（200×）
Figure 5Histopathology of lung tissues in the low dose of Sauropusspatulifolius group (200×)组别N
Mo De H L 剂量/(g·kg ‐1)
--
0.00055.4
1.35
ρ（IL‐5）/（pg ·mL -1）18.11±2.83
35.37±2.56**12.05±2.46##17.18±5.84##18.81±4.35##ρ（TXB2）/（pg ·mL -1）207.69±17.62
321.88±46.90**205.48±40.45##181.16±19.84##205.12±37.08##ρ（6‐keto‐PGF1a ）/（pg ·mL -1）
108.55±6.0998.56±2.83**
国民党王牌军覆灭记134.07±28.10##120.19±13.38##
124.94±25.41#TXB2/6‐keto‐PGF1a
1.91±
2.89
3.27±16.571.53±1.44##1.51±1.48##1.64±1.46##
表1各组大鼠血清中炎性因子水平比较
Table 1Comparison of inflammatory factors in serum of rats in each group (x ±s ,n =8)
与N 组比较：**P<0.01；与Mo 组比较：#P<0.05，##
P<0.01
。
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