2021年5月
第31卷㊀第5期
中国比较医学杂志
CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINE
May,2021跨国公司经营与管理
Vol.31㊀No.5
刘维静，聂宇，廉虹，等.小鼠出生后早期心脏成纤维细胞数量及性状变化研究[J].中国比较医学杂志,2021,31(5):28-35.Liu WJ,Nie Y,Lian H,et al.Changes of number and characteristics of heart fibroblasts in early postnatal mice [J].Chin J Comp Med,2021,31(5):28-35. doi:10.3969/j.issn.1671-7856.2021.05.005
[基金项目]国家自然科学基金(81500364)；山西省重点研发计划项目(201903D321091)㊂
[作者简介]刘维静(1996 )，女，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学㊂E-mail:liuwjsx001@16
3
[通信作者]王玉瑶(1981 )，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：心血管疾病与心肌再生㊂E-mail:wyybio@163
廉虹(1982 )，女，博士，助理研究员，研究方向：心血管疾病与心肌再生㊂E-mail:lian_hong1982@163
∗
共同通信作者
小鼠出生后早期心脏成纤维细胞数量及性状
变化研究
刘维静1，聂㊀宇2，廉㊀虹2∗，王玉瑶1∗
(1.山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，太原㊀030001;2.中国医学科学院北京协和医学院国家心血管病中心阜外医院心血管疾病国家重点实验室，北京㊀100037)
希洛人
㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀心脏成纤维细胞占心脏细胞数量的50%以上，在心脏生理病理过程中发挥重要作用㊂小鼠
出生后7d 是心脏失去再生能力的时间转折点，本研究着眼于研究心脏成纤维细胞在小鼠出生后早期数量及性状的变化情况，为心肌再生机制研究提供基础性实验数据㊂方法㊀出生1d 和7d 的C57小鼠进行心尖切除手术(Apex resection,AR)，体视镜拍照及HE 染观察心尖处切口,21d 后观察再生情况；分离出生后1d 和7d 的C57小鼠心脏组织，称取心脏湿重比较重量差异，病理切片进行HE 染观察两个时间点的心脏病理结构，免疫荧光染观察1d 和7d 心脏组织中成纤维细胞数量变化；为了更加准确定量心脏成纤维细胞的数量变化，我们利用成纤维细胞表面标志物胸腺细胞分化抗原1(Thymocyte differentiation antigen 1,Thy1)通过流式分选技术对心脏组织细胞悬液进行心肌成纤维细胞的分选，比较1d 和7d 小鼠心脏组织中心肌成纤维细胞比例；为了验证心脏成纤维细胞性状是否发生变化，我们分离1d 和7d 小鼠心脏成纤维细胞，分析成纤维细胞的特异性标志物Thy 1㊁成纤维细胞特异性蛋白(Fibroblast-specific protein 1,Fsp-1)㊁骨膜蛋白(Periostin )㊁血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor α,Pdgfrα)㊁Ⅰ型胶原α1(Collagen alpha-1,Col 1a 1)㊁转录因子21(Transcription factor 21,Tcf 21)在mRNA 水平的表达变化情况㊂结果㊀出生1d 的小鼠心尖切除手术后21d 可以完全再生(再生率为 86.67%)，而7d 小鼠手术后不能完全再生(再生率为0)；小鼠出生后7d 心脏组织平均比1d 心脏湿重重
13.13mg(3.11倍)(1d:(6.22ʃ0.19),7d:(19.35ʃ0.56),P <0.0001;n =6)㊂心脏成纤维细胞免疫荧光染证明,7d 心脏成纤维细胞数量明显高于1d 心脏；流式细胞分选证明小鼠出生后7d 心脏组织中心肌成纤维细胞占总细胞比例比出生后1d 时高2.9%(1.38倍)(1d:(7.7ʃ0.74),7d:(10.6ʃ0.95),P =0.029;n =3)；在成纤维细胞转录水平，成纤维细胞标志蛋白Thy 1㊁Fsp-1㊁Periostin 在小鼠出生后7d 表达高于出生后1d 的成纤维细胞(Thy 1:1d:(1.01ʃ0.12),7d:(2.71ʃ0.27),P =0.0288;Fsp-1:1d:(1.04ʃ0.27),7d:(5.28ʃ0.10),P =0.0046;Periostin :1d:(0.91ʃ0.01),7d:(1.13ʃ0.05),P =0.0119;n =3)，而Pdgfrα㊁Col 1a 1㊁Tcf 21三种成纤维细胞标志蛋白表达则低于出生后1d 的小鼠心脏中的成纤维细胞(Pdgfrα:1dL:(1.09ʃ0.04),7d:(0.62ʃ0.01),P =0.0068;Col 1a 1:1d:(1.00ʃ0.09),7d:(0.57ʃ0.02),P =0.0433;Tcf 21:1d:(1.00ʃ0.03),7d:(0.54ʃ0.02),P =0.0054;n =3),
证明出生后1d 到7d 的过程中心脏成纤维细胞性状发生了变化㊂结论㊀小鼠出生后早期(1d 和7d)心脏成纤维细胞的比例和性状均发生了明显变化，为研究哺乳动物心肌再生能力的丢失的机制研究提供一定的线索㊂十一届全国人大二次会议
ʌ关键词ɔ㊀小鼠；心脏成纤维细胞；流式细胞分析术；成纤维细胞性状
ʌ中图分类号ɔR-33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1671-7856(2021)05-0028-08
Changes of number and characteristics of heart fibroblasts in early
postnatal mice
LIU Weijing1,NIE Yu2,LIAN Hong2∗,WANG Yuyao1∗
(1.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Shanxi Medical University,Taiyuan030001,China.
2.State Key Laboratory of Cardiovascular Disease,Fuwai Hospital,National Center for Cardiovascular Disease,
Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing100037)
㊀㊀ʌAbstractɔ㊀Objective㊀Cardiac fibroblasts account for more than50%of heart cells and play an important role in the physiological and pathological processes of the heart.Seven days of age is an important turning point in mice when the heart loses its ability to regenerate.This study analyzed the changes in the number and characteristics of cardiac fibroblasts in the early postnatal period of mice,and provides basic experimental data for the study of the myocardial regeneration mechanism.Methods㊀Apical resection(AR)was performed on1-day-old and7-day-old C57mice.The apex incision was photographed with a stereoscope and stained with hematoxylin and eosin(HE),an
d regeneration was observed at21days post resection.Heart tissues of C57mice at postnatal day1(P1)and P7were isolated and weighed to compare the wet weight.Cardiac pathological structures at the two time points were observed by HE staining in pathological sections,and fibroblasts were observed by immunofluorescence staining.To accurately quantify the number of cardiac fibroblasts,we used fibroblast surface marker thymocyte differentiation antigen1(Thy1)to sort cardiac tissue cell suspensions by flow sorting technology.To investigate changes in cardiac fibroblast characteristics,we isolated mouse cardiac fibroblasts on P1and P7 and analyzed the mRNA expression of fibroblast marker proteins Thy1,fibroblast-specific protein1(Fsp-1),Periostin, platelet-derived growth factor receptorα(Pdgfrα),collagen alpha-1(Col1a1),and transcription factor21(Tcf21). Results㊀Heart tissue of1-day-old mice could regenerate(regeneration rate was86.67%)21days after apical resection, whereas that of7-day-old mice could not regenerate(regeneration rate was0).The average wet weight of heart tissue in mice at P7was13.13mg(3.11times)heavier than that at P1(P1:6.22ʃ0.19,P7:19.35ʃ0.56,P<0.0001;n= 6).Immunofluorescence staining indicated that the number of cardiac fibroblasts at P7was significantly higher than that at P1.Flow cytometry showed that the proportion of cardiac fibroblasts to total cells in heart tissue at P7was2.9%(1.38 times)higher than that at P1(P1:7.7ʃ0.74,P7:10.6ʃ0.95,P=0.029;n=3).At the level of fibroblast transcription,Thy1,Fsp-1,and Per
iostin expression was higher at P7than at P1(Thy1:P1:1.01ʃ0.12,P7:2.71ʃ0.27,P=0.0288;Fsp-1:P1:1.04ʃ0.27,P7:5.28ʃ0.10,P=0.0046;Periodin:P1:0.91ʃ0.01,P7:1.13ʃ0.05,P=0.0119;n=3),and Pdgfrα,Col1a1,and Tcf21expression was lower at P7than at P1(Pdgfrα:P1:1.09ʃ0.04,P7:0.62ʃ0.01,P=0.0068;Col1a1:P1:1.00ʃ0.09,P7:0.57ʃ0.02,P=0.0433;Tcf21:P1:1.00ʃ0.03,P7:0.54ʃ0.02,P=0.0054;n=3),which indicated that cardiac fibroblast traits changed during the period from 1to7days after birth.Conclusions㊀The proportion and characteristics of cardiac fibroblasts in mice changed significantly during the early postnatal period(1to7days),which provides some clues to the mechanism of the loss of mammalian myocardial regeneration.
ʌKeywordsɔ㊀mice;cardiac fibroblasts;flow cytometry;fibroblasts characters
㊀㊀心血管疾病(心肌梗死㊁心衰等)最终的结局均会导致心肌细胞的丢失，大量研究表明，成年哺乳动物心肌细胞处于终末期分化状态而不能通过有丝分裂进行增殖，再生能力非常有限[1-2]㊂因此，心肌再生的机制研究一直是心血管疾病领域的研究热点㊂小鼠是心血管疾病领域研究中使用最为广泛的哺乳动物模型之一[3]㊂2011年,Porrello课题组在新生小鼠出生后第1天切除约15%的心尖部分,21天后心脏可以完全再生，但在出生后第7天进行心尖切除后心脏却失去再生能力，只能出现疤痕修复[4]㊂1d和7d心脏组织再生能力改变的原因一直是近年来研究的热点[5-7]㊂心脏成纤维细胞占整个心脏组织的50%以上，在心脏中起到分泌胶原和生长因子等作用，是构成细胞外基质的一类重要细胞类型，在
维持心脏结构和功能中发挥重要作用[8]㊂近年研究表明，心脏成纤维细胞在心肌再生领域中发挥了重要作用[9-11]㊂本文通过比较小鼠出生后1d和7d的心脏组织中成纤维细胞数量的变
化以及对这两个时间点的成纤维细胞标志蛋白在转录水平的分析，探究了小鼠出生1d和7d心肌成纤维细胞的比例和性状变化，为研究心肌成纤维细胞在再生领域的研究提供基础性研究数据㊂
1㊀材料和方法
1.1㊀实验动物
80只出生1d(1.2~1.5g，误差小于10%)和60只出生7d(4.5~4.8g，误差小于10%)的SPF 级别C57BL/6J小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0011]，不区分雌雄㊂小鼠的模型制作以及取材均在中国医学科学院阜外医院国家心血管病中心E座屏障设施内进行[SYXK(京)2017-0015]㊂动物实验中涉及的动物所有操作程序符合3R原则，已得到中国医学科学院阜外医院实验动物管理和使用委员会的批准(FW-2019-0005)㊂
1.2㊀主要试剂与仪器
BD Aria II流式细胞仪(FACSAria2，美国)；体式显微镜(Zeiss，德国)；全自动组织脱水机(Leica，德国)；展片机(Leica，德国)；烤片机(Leica，德国)；荧光共聚焦显微镜(Zeiss，德国)；全自动扫片机(Z
eiss，德国)；普通PCR仪(Bio-Rad，美国)；实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国);DMEM(Gibco，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；含EDTA的胰酶(Gibco，美国);Masson染试剂盒(Sigma);anti-sarcomeric alpha actinin(1ʒ200,ab9465,Abcam，英国),anti-Vimentin(1ʒ100,ab92547,Abcam，英国); Neonatal Heart Dissociation Kit(Miltenyi公司，德国);Gentle MACS Octo Dissociator仪器(Miltenyi公司，德国);Neonatal Cardiac Fibroblast Isolation Kit (Miltenyi公司，德国);SYBR Green qPCR Master Mix(A25742，美国Applied Biosystems)㊂
1.3㊀实验方法
1.3.1㊀流式细胞分选
流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选，检测悬浮在液体中的单个分散细胞以及其它微粒信号，一般先将待测样本荧光染后制备为悬液标本，在周围气体压力下待测样本流入流动室，鞘液从鞘液管中流出，包裹着待测样本高速流动，形成鞘流，待测细胞分开为单个细胞依次通过检测区域，达到细胞分选的目的[12]㊂
(1)样本制备
①小鼠心脏的获取
出生1d的小鼠40只，出生7d的小鼠20只，使用75%乙醇对小鼠进行消毒，快速取出心脏，剪掉连带血管组织,PBS冲洗3次，将心脏中血液冲洗干净备用，此过程在冰上操作㊂
②剪碎，消化心脏组织，收集细胞
将取出的心脏组织置于10cm直径的培养皿中，剪碎至大约每小块1mm3，置于带有自制转子的三角烧瓶中，加入10mL0.08%的胰酶的消化液，放入磁力搅拌的水浴锅中，调节温度30ħ，消化8 min，弃掉上清(首次消化除去血细胞)㊂继续加入10mL0.08%的胰酶进行消化8min，吸取上清经40μm的筛子过滤后，置于10mL含10%FBS的DMEM中，此过程重复操作7~8次后，组织块成絮状，说明细胞基本无残留，终止消化过程，将收集到的细胞悬液，室温1200r/min,5min离心，收集细胞㊂
(2)细胞分选
①制备上机悬液
将收集好的细胞使用PBS冲洗一次,1ˑ106细胞量为一个反应，成纤维细胞表面标志物Thy1-APC 抗体以1ʒ100的比例稀释，同时做好阴性对照和同型对照(Isotype control)㊂混匀后冰浴30min，后1200r/min,5min离心，弃上清，再次使用PBS清洗一次，最后40μm细胞过滤筛子过滤至流式管中，待上机㊂
②流式上机分选
细胞悬液上机前5min加入活性染料7-AAD，混匀，上机，收集分选后的心肌成纤维细胞，分选结束后，将分选出的阳性细胞管进行回测实验，验证细胞纯度㊂所有流式细胞术均在BD Aria II流式细胞仪上进行，分选目的细胞的电压分别为,FSC:100 V,SSC:250V,APC:181V㊂
1.3.2㊀心尖切除
出生1d和7d的小鼠分别埋于碎冰中冰冻麻醉2min和5min，医用胶带将小鼠四肢固定在预冷的微型金属手术台上，将其置于体式显微镜下,75%乙醇对小鼠胸前皮肤进行消毒㊂用显微剪于小鼠第4~5肋间隙剪开长约1cm的切口，随后利用眼科镊撑开胸腔，轻轻撕掉心包膜，采用显微镊在切口外端轻微按压挤出心脏，之后使用虹膜剪剪去心脏部分左心室心肌组织，左心室轻微渗血即可，随后将心脏送回胸腔㊂8-0涤纶线缝合小鼠皮肤后，将小鼠置于37ħ恒温台数分钟，待小鼠完全恢复呼吸㊁活动自由后放回母鼠笼中㊂
1.3.3㊀组织学检测
对出生1d和7d的小鼠分别进行心尖切除
(AR,Apical resection)，术后21d取完整心脏,4%多聚甲醛固定48h，脱水后进行石蜡包埋，以5μm 的
厚度切片㊂按照之前研究操作[13]，将石蜡切片放在烤片机上68ħ烘烤45min防止脱片，随后将玻片依次放入二甲苯Ⅰ㊁Ⅱ各10min,100%㊁95%㊁80%㊁75%㊁50%梯度乙醇中各5min进行脱蜡㊁水化，之后在重铬酸钾中过夜，使用Masson染试剂盒进行染，根据Masson染方法，苯胺蓝染液将胶原纤维染为蓝即为组织纤维化㊂若心尖处无蓝纤维化组织则可视作心脏完全再生，若心尖处存在纤维化组织则为心脏不完全再生，再生率是指术后完全再生小鼠只数占所有手术小鼠只数百之比㊂对于HE染，则需将玻片在烤片机上68ħ烘烤45min 后直接进行染㊂
1.3.4㊀免疫荧光染
取1d和7d小鼠完整心脏,4%多聚甲醛固定24h，脱水后进行石蜡包埋，以5μm的厚度切片㊂根据之前研究[13]，脱蜡水化之后使用EDTA修复法高温修复2min，使用含Triton-X100的山羊血清封闭液封闭1h，在4ħ孵育一抗过夜:anti-sarcomeric alpha actinin(1ʒ200;ab9465,Abcam,UK),anti-Vimentin(1ʒ100;ab92547,Abcam,UK)㊂室温复温1h，使用PBS将玻片洗涤5次，每次5min，在室温与荧光标记二抗避光孵育1h,PBS洗涤玻片5次，每次5min，然后使用含DAPI的封片剂封片㊂我们使用蔡司LSM800共聚焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss,Inc.,Jena,Germany)检测荧光强度㊂1.3.5㊀心脏组织成纤维细胞分离
取1d和7d小鼠完整心脏各20只，剪掉血管连带组织，在PBS缓冲液中冲洗3遍，放入含有酶液(含酶A:
12.5μL㊁酶P:62.5μL㊁酶D:100μL㊁缓冲液Y:25μL㊁缓冲液X:2300μL)的C管中，利用Neonatal Heart Dissociation Kit及Gentle MACS Octo Dissociator仪器消化心脏；消化结束后立即用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM终止消化,70μm 滤网过滤,1000r/min离心5min，弃上清，使用红细胞裂解液裂解红细胞,3min后使用PBS缓冲液终止裂解,1000r/min离心5min；使用含有稳定剂和0.05%叠氮化钠的缓冲液重悬,30μm滤网过滤，使用Count Star进行细胞计数，按照5ˑ106细胞量为一个体系，使用Neonatal Cardiac Fibroblast Isolation Kit分离成纤维细胞㊂
1.3.6㊀qRT-PCR
使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取分离的心脏成纤维细胞中的RNA，然后使用PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa,RR036A)将其转化为cDNA㊂使用SYBR Green qPCR Master Mix进行qRT-PCR，并在Vii7Real-Time PCR System上扩增，扩增条件为95ħ预变性2min，后95ħ运行15s进行变性, 60ħ运行15s进行退火,72ħ运行1min进行延伸，变性㊁退火㊁延伸过程共进行40个循环㊂下面列出了该反应的所有引物㊂Thy1正向:5ᶄ-GGAACTCTTGGCACCATGAAC-3ᶄ，反向:5ᶄ-TTATTCTCATGGCGGCAGTC-3ᶄ;Fsp-1正向:5ᶄ-GGAGGCCCTGGATGTAATTGTG-3ᶄ，反向:5ᶄ-CAACTTCATTGTCCCTGTTGCTG-3ᶄ;Periostin正向: 5ᶄ-ACTGAATGCCTTACACAGCCACA-3ᶄ，反向:5ᶄ-TCGAGCACAGTTCACAGTGACAA-3ᶄ;Pdgfα正向: 5ᶄ-GGCAGGCACATTTACATCTATG-3ᶄ，反向:5ᶄ-CATCCTCTTCCACGATGACTAA-3ᶄ;Col1a1正向:5ᶄ-TGAACGTGGTGTACAAGGTC-3ᶄ，反
向:5ᶄ-CCATCTTTACCAGGAGAACCAT-3ᶄ;Tcf21正向:5ᶄ-GCGATGTAGAAGACCTTCAAGA-3ᶄ，反向:5ᶄ-GAAGTTCCAAACTCCTTGTTGG-3ᶄ;Gapdh正向:5ᶄ-GCAGTGGCAAAGTGGAGAATTG-3ᶄ，反向:5ᶄ-AGAGATGATGACCCTTTTGGCTCC-3ᶄ㊂
1.4㊀统计学方法
使用GraphPad Prism(7.0版,GraphPad软件)分析所有结果㊂所有数据均表示为平均数ʃ标准差( xʃs)㊂组间差异通过未配对的t检验进行评估㊂显著性水平由Prism软件得出,∗P<0.05被认为是有统计学差异㊂
2㊀结果
2.1㊀小鼠出生1d和7d心脏组织的变化
按照之前报道的心尖切除操作方法[14]，我们对出生1d和出生7d的小鼠分别进行了AR(图1A)，石蜡切片进行HE染观察切口处病理结构(图1B)，与之前研究相一致，术后21d发现出生1 d进行AR的小鼠可以完全再生(再生率为87.67%)，而出生7d进行AR的小鼠术后21d无法再生(再生率为0)(图1C㊁1D)㊂为了解小鼠出生后7d心脏组织的变化情况，我们分别取1d和7 d小鼠完整心脏，称取小鼠心脏湿重，同时对两个时间点小鼠心脏进行拍照比较小鼠心脏大小(图1E)，石蜡切片进行HE染观察其病理
dna双螺旋
结构(图1F)，发现小鼠出生后7d心脏组织平均比1d心脏湿重重13.13mg(3.11倍)(1d:(6.22ʃ0.19),7 d:(19.35ʃ0.56),P<0.0001;n=6)(图1G)㊂心脏成纤维细胞免疫荧光染证明,7d心脏成纤维
细胞数量明显高于1d 心脏(图1H㊁1I)㊂以上结果说明，小鼠出生早期心脏体积随着心脏发育增大的同时，心脏成纤维细胞数量也随之增加
汉语音译㊂
注:A：出生1d 和7d 小鼠分别进行心尖切除即刻进行拍照;B：出生1d 和7d 小鼠分别进行心尖切除石蜡切片进行HE 染;C：出生1d 和7d 小鼠分别进行心尖切除，术后21d 进行Masson 染;D：小鼠出生1d 和7d 分别进行心尖切除，术后21d 统计再生率;E：小鼠出生1d 和7d 完整心脏进行拍照;F：小鼠出生1d 和7d 心脏切片进行HE 染;G：出生1d 和7d 小鼠心重比较;H：出生1d 和7d 小鼠心脏切片心肌细胞与成纤维细胞共染;I：出生1d 和7d 小鼠心脏切片对成纤维细胞进行免疫荧光染㊂
图1㊀小鼠出生1d 和7d 心脏组织的变化
Note,A,Apical resection was performed on day 1and day 7mice respectively,the heart was photographed immediately.B,Apical resection was performed on day 1and day 7mice respectively,the heart section of the mouse was stained with HE.C,Apical resection was performed on day 1and day 7mice respectively,and Masson staining was performed at 21days after the operation.D,Apical resection was performed on day 1and day 7mice,and regeneration rate was counted at 21day after operation.E,The whole heart of the mouse was photographed on day 1and day 7.F,The heart section of the mouse was stained with HE on day 1and day 7.G,The heart weight of the mouse was compared on day 1and day 7.H,Cardiomyocytes and fibroblasts co-stained in 1day and 7days of mouse heart sections.I,Immunofluorescence staining of
fibroblasts in 1day and 7days of mouse heart sections.
Figure 1㊀Changes of heart tissue in mice on day 1and day 7
2.2㊀流式细胞术分选心脏成纤维细胞2.2.1㊀流式细胞术分选心脏成纤维细胞的圈门
渡边淳一
策略
为了分析小鼠出生后7d 心脏成纤维细胞数量的变化情况，我们使用成纤维细胞表面标志蛋白
Thy1标记出生1d 和7d 的小鼠心肌成纤维细胞，通过流式细胞术进行细胞分选㊂首先，我们通过正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)散点图，去除细胞碎片以及黏连细胞圈出P1门(图2A),P1门中的细胞开展后续分析㊂为了避免背景荧光及自发荧光的影响，收集分离后未染的细胞作为空白对照(Blank，图2B)；收集加入无荧光染料的单个抗体的细胞作为同型对照(图2C)，以此判断抗原抗体的
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