1、取材 选材部位以病灶与正常组织交界处的组织标本为好,取材要完整,要尽可能注意到整个器官的结构特点。大小一般是1cm×1 cm×0.5 cm为宜。
在夹取组织时不要用力压、挤、揉等以免损坏组织。
2、固定 以10%中性福尔马林固定液(固定液的量应为组织块的10-20倍)固定时间24-36小时。组织长时间固定,固定液中的福尔马林含有的杂质会产生一种酸,影响核的染,整个组织显得非常陈旧。
3.1、脱水 组织经固定后,内含大量水分,须除尽水分才利于透明、浸蜡。常用酒精为脱水剂,逐级提高酒精浓度,以防组织过度收缩、变脆或脱水不完全而影响制片效果。脱水一般在室温下进行,由60%酒精、70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、爱过分100%酒精I、100%铜钼酒精II组成。组织块在酒精中时间不宜过长,否则组织块容易变硬。
如切片后的蜡块中央呈灰白粗糙而不透亮,放置一段时间后蜡块中央出现一陷窝,此即表明组织脱水不够彻底,组织面暴露后水分蒸发,蜡块中央收缩形成陷窝,严重时难以切出完整切片。注意定时更换新的脱水剂,一般在使用到1500个脱水盒(含组织块)后即可考虑更换脱水液。 3.2、透明 在室温下,组织块采用二甲苯或TO透明剂中进行透明。一般透明剂分为I、II两个试剂缸。组织在二甲苯或TO透明剂中贮留时间必须严格掌握,时间稍长,则组织脆硬易碎;时间过短,石蜡不易渗透进去,使浸蜡不完全。 3.3、浸蜡 恒温杯内温度应调至58-60℃为宜,使石蜡熔化完全。石蜡分为I、II两个缸。尽量控制组织块在石蜡中的浸泡时间,时间过长组织易碎;时间过短,石蜡未渗透进去,组织不能切片。
附:自动脱水机使用操作规程
LEICA TP1020自动脱水机工作程序 |
顺序 | 试剂名称 | 时间 |
(1) | 中性甲醛 | 1 h |
(2) | 60%乙醇 | 1 h |
(3) | 70%乙醇 | 1 h |
(4) | 80%乙醇 | 40 min |
(5) | 90%乙醇 | 40 min |
(6) | 95%乙醇 | 40 min |
(7) | 100%乙醇 | 35 min |
(8) | 100%乙醇 | 30 min |
(9) | 透明剂I | 30 min |
(10)2011年江苏高考语文试卷 | 透明剂II | 25 min |
(11) | 石蜡I | 1.5 h |
(12) | 石蜡II | 2.5 h |
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4、包埋 将温箱中熔化好的石蜡倒进包埋框内,迅速用热镊子将组织放入包埋模具内,将要切的面朝下并摆正位置,多块的小的组织应集中放在一起,处于一个水平面上,管状组织如血管、气管、肠道等须立起来包埋,然后压上塑料盒,再注入少量的石蜡液,将其移放室温下一定时间后,再转移至冰冻台上冰冻固定,待其蜡块完全凝结后,取出蜡块,修切去抱抱盒周边浓度余蜡。
5、在普通载玻片上涂一层合适的组织粘附液,或使用免疫组化专用载玻片。
6、切片 在切片前,须对蜡块进行修切,如此才能适合于切片。切片机装上锋利的切片刀(刀的斜度为5度),调节器调在4-6微米厚度,调整蜡块切面使之与刀口平行。左手平持毛笔,右手旋动切片机把,切片带出来之后,用毛笔轻轻托起,切片切取一定长度之后,用毛笔或镊子轻轻取起石蜡切片,平铺于摊片机恒温水里,使石蜡切片展平。
7、裱片 摊烘烤片机内水温保持在40-45℃,将切片光泽面向下铺于温水上。等切片展开后用清洁的载玻片从水中捞出,拨正位置,把贴好切片的载玻片放在摊烘烤片机的烤片板上,烤干水分。
8、烤片 把贴有切片的载玻片直立放在染片架上,送入59~63℃左右的温箱中烘烤4~6小时,直到蜡片融化,组织片成半透明状。注意烤片温度的控制。
9、二甲苯或TO透明剂脱蜡,降梯度酒精洗脱,最后自来水冲洗。
10、将1500mL抗原修复液放入不锈钢高压锅中加热直至沸腾,盖上锅盖,但不盖紧、不关闭加压阀。
11解放军264医院、将染架放入高压锅内,让切片完全浸没再修复液中,盖上锅盖,关闭加压阀。
12、计时月6min。关闭电源,打开加压阀,并于其上加盖一湿毛巾。高压蒸汽未放完严禁打开锅盖。
13、压力正常后,打开锅盖,取出高压锅内胆,放入预放好的冷水中冷却。
14、取出染架,立即放入自来水中冲洗。
15、PBS冲洗。
16、3%H2O2液阻断内源性过氧化物酶,室温孵育10min。
17、流水冲洗,PBS液洗,擦干切片组织周围表面水分,PAP笔划圈;
18、滴加稀释的正常血清孵育10min。
19、用最佳稀释浓度的一抗工作液孵育,室温或37℃下2~3小时。PBS冲洗。
20、滴加生物素标记的羊抗兔/鼠二抗工作液,室温下孵育20min。PBS冲洗。
21、滴加HRP标记的链霉亲和素(三抗),室温下孵育20min。PBS冲洗。
22、DBA显工作液孵育3~10min。PBS冲洗。
23、苏木素复染,脱水、透明盒封片。
结果:阳性物质在胞(浆)内呈棕黄细颗粒状。山东瑞华工程机械有限公司
免疫组织化学染结果判断:
细胞相应部位(细胞核、细胞浆、细胞膜等)出现黄反应为阳性,以阳性对照成份阳性而检测部分无反应为阴性。根据显强度和阳性细胞数两项指标判断阳性等级。按显强
度分为无、淡黄,黄、棕黄,分别计为0、1、2、3分;按阳性细胞占同类细胞的比例分为0、<1/3、1/3~2/3、>2/3,分别计为0、1、2、3分。将两项积分相乘,确定快乐点击0分为阴性,1~3分为弱阳性,4~6分为中等阳性,9分为强阳性,分别计为—、+、++、+++。
注意事项: ① 操作过程中组织必须保持在湿润状态,不能干燥;② 所加试剂以完全覆盖组织为度。