扇贝养殖海区中小型浮游生物携带AVNV的荧光定量检测

剑舞翩跹扇贝养殖海区中小型浮游生物携带AVNV的荧光定量检测

蔡玉勇;任伟成;曲朋;贾志磊;王崇明;李赟

【摘要】为了解中小型浮游生物与扇贝急性病毒性坏死症(AVND)的流行传播关系,于2009年对青岛流清河与荣成桑沟湾2个不同扇贝养殖海区的浮游生物进行了采样调查,利用荧光定量PCR(Fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术对所采集样品携带急性病毒性坏死病毒(AVNV)的情况进行了定量检测.结果表明,2个扇贝养殖海区的浮游生物样品均检测到AVNV,而且不同粒径的浮游生物携带AVNV载量有差异(P<0.05):小于200目粒径的浮游生物携带AVNV载量最大,达到9.45×106 copy/mg (DNA)； 60～200目粒径的浮游生物次之,大于60目粒径的浮游生物携带量最少,仅为5.81×104 copy/mg(DNA).在上述2个扇贝养殖海区,均在8月份检测到浮游生物携带AVNV.该结果与栉孔扇贝夏季大规模死亡在时间上是吻合的.结论认为,中小型浮游生物可以携带AVNV,并有可能在扇贝急性病毒性坏死症的流行和传播中起到传播媒介的作用.

少年天地【期刊名称】《中国水产科学》

【年(卷),期】2011(018)004

【总页数】7页(P735-741)

【关键词】急性病毒性坏死病毒;栉孔扇贝;浮游生物;病携带;荧光定量技术

【作者】蔡玉勇;任伟成;曲朋;贾志磊;王崇明;李赟

【作者单位】中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071;中国海洋大学,山东青岛 266003;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071;中国海洋大学,山东青岛 266003;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071;中国海洋大学,山东青岛 266003;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071;中国海洋大学,山东青岛 266003

【正文语种】中文

【中图分类】S944

急性病毒性坏死病毒(Acute Viral Necrosis Virus,AVNV)是引起中国北方沿海养殖栉孔扇贝(Chlamys farreri)夏季大规模死亡(急性病毒性坏死症,Acute Viral Necrosis Disease,AVND)

的直接病原[1–3]。目前,在明确病原的前提下,已完成了AVNV 的流行病学[4]和组织病理学[5-6]的研究,并建立了间接ELISA[7]、间接免疫荧光(IIF)[8]、聚合酶链反应(PCR)[9]、环介导等温扩增(LAMP)[10]和荧光实时定量PCR(FQ-PCR)[11]等检测方法。这些研究在检测技术层面为研究该病原的流行传播过程奠定了基础。病毒的传播途径大致可以分为 2条: 一条是垂直传播;另一条是水平传播。于佐安等[12]已初步探明AVNV不存在卵内垂直传播的可能。有关浮游生物是否携带 AVNV以及 AVNV水平传播途径的研究至今尚未见相关报道。浮游生物包括浮游动物和浮游植物,是扇贝的主要饵料生物,因此检测扇贝养殖海区浮游生物是否携带AVNV对调查AVNV的传播途径具有重要意义。

本研究通过对青岛流清河和荣成桑沟湾2个扇贝养殖海区连续定期采集浮游生物样品,进行了浮游生物主要类和优势种的调查,并利用FQ-PCR技术对浮游生物携带AVNV的情况进行了定量检测,以期探讨浮游生物携带AVNV状况及其与扇贝急性病毒性坏死症流行与暴发的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

法拉第筒

1.1.1 样品采集与处理 2009年4–11月,定期在流清河和桑沟湾扇贝养殖海区采集浮游生物样品。浮游生物的采集方法是利用浅水Ш型浮游生物网(网口直径37 cm,网衣孔径0.077 mm,网长140 cm)垂直拖取水深 10 m处到水面的样品,采集的样品用 5%(V/V)的福尔马林溶液固定保存,进行种类鉴定和细胞计数(海洋调查规范)[13];重新拖取1网样品收集到500 mL 广口瓶中4℃保存,实验室内用孔径为60目、200目筛卷依次分级过滤,过滤后水样以120 000 r/min 离心30 min,取沉淀。将过滤和离心所得样品收集到1.5 mL 离心管中用于总DNA提取。

1.1.2 引物与探针用于 FQ-PCR检测采用任伟成等[11] 设计的引物,扩增引物上游序列 c-f:5′-AGC CTT TTA CAG AAT TTT GCA CCT T-3′,下游序列 c-r: 5′-TGT CGC ATG TTA ACC TCG TCT G-3′,扩增片段大小为90 bp。Taq Man探针序列为,5′-FAM-AGC CAT CAC ATC AGC CAG CAA CGA CT-TAMRA-3′。引物和Taq Man探针均委托大连TaKaRa生物工程有限公司合成。

1.2 浮游生物总DNA提取亚洲霸王龙足迹

利用OMEGA微量基因组提取试剂盒提取浮游生物总DNA,DNA提取所用试剂全部来自试剂

盒。向含有的浮游生物的 1.5 mL离心管中加入200 µL Buffer TL,加入 25 µL OB 蛋白酶,混匀,55℃水浴至组织完全消化,每隔20～30 min混匀1次。室温10 000 g离心5 min去除杂质,小心转移上清液至一个新1.5 mL离心管中。加入220 µL Buffer BL涡旋混匀,70℃水浴10 min。加入220µL无水乙醇,高速涡旋15 s混匀。转移混合液至套有收集管HiBind DNA柱子中,室温下8 000 g离心 1 min,弃去滤液。把柱子重新装进收集管,加入500 µL HB Buffer,室温下8 000 g离心1 min,弃去滤液。把柱子重新装进收集管,加入700 µL DNA Wash Buffer,室温下8 000 g离心1 min,弃去滤液,重复操作一次。弃去滤液,把柱子重新装回收集管,12 000 g离心空柱2 min以甩干柱子基质。把柱子装在干净的1.5 mL离心管上,加入50µL 70℃预热的 Elution Buffer到柱子基质上,室温下静置3 min后,室温10 000 g离心1 min以洗脱 DNA,保留含 DNA的洗脱液。利用超微量分光光度计(ThermoScientific NanoDrop2000c)对DNA的浓度和纯度进行分析。

1.3 质粒提取天网防火

FQ-PCR所用阳性对照质粒由任伟成等[11]构建,以 AVNV基因组全序列为模板,选取保守序列,PCR扩增后,纯化阳性PCR产物并将其插人到PGEM-T(Premaga)质粒载体中构建重组质

粒。将该重组质粒转化到DH-5α工程菌内增殖。利用威格拉斯高纯度质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA,质粒提取所用试剂全部来自试剂盒。取过夜培养菌 1～3 mL菌液,装入 1.5 mL离心管中,12 000 g于室温离心2 min沉淀菌体,完全弃除上清。加入200 µL Buffer P1,充分混悬震荡菌体沉淀10～15 s,使其完全分散开,至无絮块存在。加入 200 µL Buffer P2,轻轻颠倒离心管 3～5次,室温放置2～3 min,使细菌完全裂解,溶液透明。裂解时间不要超过5 min。加入300 µL Buffer P3,轻轻颠倒离心管4～6次,充分混匀,室温放置1 min,可见白絮状物产生。于室温12 000 g离心8 min,小心吸出上清,转移至插入套管的离心柱内,于台式离心机上高速离心 30 s。弃去套管内废液,再将离心柱插回套管。向离心柱内加入 Buffer PWT(洗涤液T)500 µL,高速离心20 s,弃去套管内废液,将离心柱插回套管。向离心柱内加入Buffer PW(洗涤液)700 µL,高速离心 20 s,弃去套管内废液,将离心柱插回套管。再次高速离心1～2 min甩干。高速离心1～2 min甩干后,小心取出离心柱,不要沾上套管内的废液。弃去套管。将离心柱插入一个新的1.5 mL离心管,在离心柱内硅胶膜中心位置加入 100 µL洗脱液(Elution Buffer),注意不要触及硅胶膜;高速离心 1 min,离心管中即得纯化的质粒 DNA溶液。获得的质粒DNA溶液,可直接应用于后续实验中,或保存于-20℃备用。质粒标准品DNA用紫外分光光度计测定浓度,10倍系列稀释成108～101质粒核酸拷贝数进行FQ-PCR。运载火箭

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