生物实验室CIK操作SOP
适用范围：生物实验室
执行日期：2013 年 10 月 1 日
启用日期：2013 年 10 月 1 日
一、血液及回输物运输标准操作程序
1. 目的：规范血液与回输物运输环节。沧州师专
2. 适用范围：运输与转交环节。
3. 职责：
3.1血液运送环节工作人员均应熟知并遵守本阶段相关SOP。
3.2 纳达尔资料本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经技术总监批准签字。昆德拉
4. 程序：
4.1 取血人员到病房与采血护士做好交接，认真核对病人信息并做好记录，准确无误后将血放入无菌盘中，签字取回。
4.2 运输人员与取血人员认真做好交接，记录病人信息，与医生申请单一同带回实验室。
4.3 运输人员到达实验室后，将装有血液的无菌盘交与实验员的同时需清楚提供病人信息（姓名、性别、年龄、科室、住院号）并附带医生申请单。
4.5 回输物送出实验室后，运输人员核对患者信息与数量。
4.6运输人员与取血人员认真做好交接，无误后进行交接签字。
1. 目的：规范外周血单个核细胞分离程序，避免污染。
2. 适用范围：外周血单个核细胞的分离。
3. 职责：
3.1 实验室工作人员均应熟知并遵守本阶段相关SOP。
3.2 本安全性SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经技术总监批准签字。
4. 程序：
4.1 装有血液的无菌盘由物流通道进入万级实验区传递窗中，紫外照射消毒。
4.2 人员由人流通道进入实验室，开启离心机进行预冷，超净台消毒。
4.3 关闭传递窗紫外灯，由无菌盘中取出血液。无菌盘无需进入万级实验区。
4.4准备50mL离心管1-2支，标记号患者姓名。在超净台内将血液从注射器中排出2-3滴至废液瓶中，然后再将剩余血样慢慢注入50 mL离心管中。离心：2800rpm，10min，4℃。
记录患者信息。
4.5准备50mL离心管一只，标记号患者姓名及日期。将上清部分加到50 mL 离心管中，使用5ml注射器吸取血浆4ml用于后期科研。（留取方法见样本留取SOP）剩余血浆56℃ 灭活30min。血浆离心2600rpm， 10min备用。
4.6将生理盐水缓缓注入沉淀中至50 mL，混匀。将血液缓慢匀速注入到淋巴细胞分离液中，避免打破页面。离心：2600rpm， 20min，常温。
4.7准备50mL离心管1-2支，标记好患者姓名。吸取每管中单个核细胞层于50 mL 离心管中，加生理盐水至50 mL。离心：2600rpm， 5min，4℃。
4.8弃掉上清，加50mL万能轧机生理盐水。离心：2600rpm， 5min，4℃
4.9重复步骤4.8一次。
4.11将培养瓶置于37℃ 5% CO2培养箱中培养。
4.12 单个核细胞分离后第二日加入20万单位IL-2一支。
三、转袋标准操作程序
1. 目的：规范转袋操作程序，避免污染。
基督教女青年会2. 适用范围：CIK细胞扩大培养操作。
3. 职责：
3.1 实验室工作人员均应熟知并遵守本阶段相关SOP。
3.2 本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经技术总监批准签字。
4. 标准操作：
4.1 旋紧培养瓶口后，将培养瓶从培养箱中取出。
4.2 倒置显微镜下观察细胞。当细胞长满整个视野，形态大而圆形时即可进行转袋操作。
4.4 用移液管吹下培养瓶中贴壁的细胞。吹吸过程中移液管尽量不要与培养瓶内壁刮碰。
4.5 向培养瓶中加入IL-2 200万IU及患者自体血浆，混合均匀。
4.6 清理超净台，对超净台台面进行消毒，取出培养袋，填写患者信息（姓名、采血日期、转袋日期）。
4.7 旋开培养袋出液口管帽，管帽过火放于高处。
4.8 取50ml注射器一只，按压外包装，确认有无破损。撕开包装，手持注射器中后部将其取出，除去针头和胶塞，检查注射器管中有无异物。注射器两端过火，连接培养袋出液口。操作过程中，注射器两端不得碰到任何东西。
4.9倒入细胞悬液。用培养基冲洗培养瓶二次。补加培养基适量（约800ml）。
4.10 弃去注射器，管口过火。管帽过火后盖好旋紧。夹子夹住管口。
4.11 用酒精棉球或喷有酒精的无菌纸巾擦拭出液管及培养袋表面，以防液体滴落滋生细菌。
4.12 核对患者信息，无误后双手托起培养袋放入培养箱中。
四、补液标准操作程序
1. 目的：规范补液操作流程，避免污染。
2. 适用范围：CIK细胞培养过程中补加培养液。
3. 职责：
3.1 实验室工作人员均应熟知并遵守本阶段相关SOP。
3.2 本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经技术总监批准签字。
4. 标准操作：
4.1 转袋后2-3天，取出培养袋。显微镜下观察细胞生长状态。
4.2 酒精擦拭超净台面，将培养袋平放入超净台中。
4.3 旋松培养液瓶口。瓶口，瓶盖过火后，备用。
4.4 旋开培养袋出液口管帽，管帽过火放于高处。
4.5取50ml注射器一只，按压外包装，确认有无破损。撕开包装，手持注射器中后部将其取出，除去针头和胶塞。注射器两端过火，连接培养袋出液口。操作过程中，注射器两端不得碰到任何东西。
4.6加入患者自体血浆适量。培养基至要求量（总体积2000ml）。
4.7 弃去注射器，管口过火。管帽过火后盖好旋紧。夹子夹住管口。
4.8 用酒精棉球或喷有酒精的无菌纸巾擦拭出液管及培养袋表面，以防液体滴落滋生细菌。双手托起培养袋放入培养箱中。
五、检菌标准操作规程
1. 目的：对培养物进行无菌检测。
2. 适用范围：适用于CIK细胞培养。
3. 职责：
3.1 实验室工作人员均应熟知并遵守本阶段相关SOP。
3.2 本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经技术总监批准签字。
4. 标准操作：
4.1 取50ml离心管一只，注明被检测患者姓名。旋松管口备用。
4.2 酒精擦拭超净台面，取出培养袋平放入超净台中。
4.3 旋开培养袋出液口管帽，管帽过火放于高处。
4.4 手持出液口，倒出10-15ml培养液。倾倒过程中管口离离心管口需高于1cm，防止二者相碰造成污染。
4.5 管口过火。管帽过火后盖好旋紧。
4.6 夹子夹住管口。用酒精棉球或喷有酒精的无菌纸巾擦拭出液管及培养袋表面，以防液体滴落滋生细菌，双手托起培养袋放入培养箱中。
4.7 取双向血培养瓶2个，检查有无破损或异物。注明被检测者姓名及检菌时间。瓶口过火，将瓶盖放于高处，接种部位过火。
4.8 取5ml注射器一只，按压外包装，确认有无破损。撕开包装后，手持注射器中后部将其取出，拔下针头帽，注射器针头过火后吸取离心管中的培养液3-5ml,注入双向血培养瓶中。
4.9 直接将针头弃于针头桶中，针管弃于垃圾袋中。
4.10 双向血培养瓶盖与操作部位过火后盖紧。一瓶封口后送检验科培养，一瓶用于自检。
六、CIK细胞回输标准操作程序
1. 目的：规范CIK细胞回输操作流程。
2. 适用范围：本SOP适用于本室各类用途使用的普通冰箱、冰柜。
3. 职责：
3.1 实验室工作人员均应熟知并遵守本阶段相关SOP。
3.2 本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经技术总监批准签字。
4. 标准操作：
4.1 （询问检验科检菌结果，）并观察自检结果，确认无菌后，进行回输操作。
4.2 取出培养袋显微镜下观察细胞状态。包体饱满且折光性好的培养物可以进行回输。
4.3 第一天回输时取 250ml离心管2个，写好患者姓名，拧松管盖。
4.4 酒精擦拭超净台面，取出培养袋平放入超净台中。旋开培养袋出液口管帽，管帽过火放于高处。
4.5 一手持出液口，管口冲下置于离心管管口上0.5-1cm处，另一只手持培养袋倒出培养液。倾倒过程中严禁出液口与离心管管口接触，防止二者相碰造成污染。
4.6 管口过火。管帽过火后盖好旋紧。夹子夹住管口。
4.7 离心管于2600rpm，5min，4℃离心。确认细胞是否已沉淀后，使用5ml注射器吸取上清4ml用于后期科研，弃去上清。拍打离心管底部，打散沉淀。
4.8 重复4.4至4.7（共倒出培养液约1000ml），倒液结束后管口过火，管帽过火后盖好旋紧。用夹子夹住管口。用酒精棉球或喷有酒精的无菌纸巾擦拭出液管及培养袋表面，以防液体滴落滋生细菌，双手托起培养袋放入培养箱中。
4.9 0.9% NaCl 重悬细胞。用移液管将细胞集中到一只250ml离心管中。
4.10离心管于2600rpm，5min，4℃离心。确认细胞是否已沉淀后，弃去上清。拍打离心管底部，打散沉淀。
4.11 重复4.10两次
4.12 0.9% NaCl 重悬细胞。
4.13 取已分装好4ml白蛋白的50ml离心管一支。
4.14 标记好患者姓名，管口过火，拧松管帽后再过火备用。
4.15 取下管盖，置于高处。止血钳过火，夹取不锈钢网置于离心管管口。
4.16 移液管吸取细胞悬液，打入离心管中，滤过大的细胞团。弃去不锈钢网，盖上管盖，拧紧并混匀。
4.17 取贴好标签的回输袋一个并核对患者姓名，剪去多余管，连接50ml注射器。再次核对患者姓名，倒入半管细胞，并添加0.9% NaCl（约150ml）。止血钳夹住进液管，热合机封口。再取另外一个回输袋，倒入剩下半管细胞，步骤如上。
4.18核对患者信息，放入传递窗中的无菌盘中，送出实验室。
4.19 回输第二天时，250ml离心管2个，写好患者姓名，拧松管盖。
4.20酒精擦拭超净台面，取出培养袋平放入超净台中。旋开培养袋出液口管帽，管帽过火放于高处。
4.21一手持出液口，管口冲下置于离心管管口上0.5-1cm处，另一只手持培养袋倒出培养液。
倾倒过程中严禁出液口与离心管管口接触，防止二者相碰造成污染。
4.22管口过火。管帽过火后盖好旋紧。夹子夹住管口。
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