胡景玉;杜红丽;乔艳梅;郭连峰;杨世金;金玉怀
【摘 要】目的 了解衡水地区大肠埃希菌的药敏情况以及qnr基因的存在情况.方法 采用肉汤稀释法测15种抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)并计算其MIC50和MIC90;采用聚合酶链反应(PCR)检测qnr基因.结果 15种抗菌药物中仅亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦对大肠埃希菌敏感,245例大肠埃希菌中检出5株存在qnrB基因,占2.0%,1株存在qnrS基因,占0.4%.结论 我院检出的大肠埃希菌存在多重耐药.少数菌株中,存在qnrB和qnrS基因,临床应加强监测.%Objective to understand the resistance characteristics as well as the distribution of qnr of E. coli in Hengshui area. Methods Minimum inhibitory concentrations ( MICs ) to 15 antibiotics of the isolates were determined by broth dillution method, and the value of MIC50 and MIC90 were calculated. Qnr genes were amplified by polymerase chain reaction ( PCR ). Results imipenem, pip-eracillin/tazobactam and cefoperazone/sulbactam is highly sensitive to E. coli,5 isolates were found carrying qnrB gene among the 245 strains of isolates ( 2. 0% ) and 1 strain was qnrS positive ( 0. 4% ). Conclusions Hospital detection of E. coli multi-drug resistant. A small number of strains, there qnrB and qnrS genes, clinical, should be strengthened to monitor.
bt欧洲【期刊名称】《临床肺科杂志》
【年(卷),期】2013(018)002
【总页数】3页(P290-292)
金昌市政府工作报告【关键词】衡水地区;MIC50;MIC90;qnr;菌落PCR
【作 者】胡景玉;杜红丽;乔艳梅;郭连峰;杨世金;金玉怀
【作者单位】053000,河北,衡水,河北医科大学附属哈励逊国际和平医院;053000,河北,衡水,河北医科大学附属哈励逊国际和平医院;053000,河北,衡水,河北医科大学附属哈励逊国际和平医院;053000,河北,衡水,河北医科大学附属哈励逊国际和平医院;053000,河北,衡水,河北医科大学附属哈励逊国际和平医院;053000,河北,衡水,河北医科大学病原生物学教研室
【正文语种】中 文
抗生素的滥用导致耐药菌呈逐年增多趋势，院内感染发生率也在不断上升。大肠埃希菌是医院感染的重要致病菌，可以导致多部位的感染，甚至败血症。随着喹诺酮耐药的检测，临床上陆续检出耐喹诺酮药物的革兰阴性菌，对其耐药机制的研究也由最初的经染体介导拓宽到经质粒传递喹诺酮耐药基因qnr。本研究旨在了解本地区大肠埃希菌的耐药情况以及qnr基因的存在与分布状况。
材料与方法
一、菌株：收集哈励逊国际和平医院微生物实验室2008年12月～2011年12月自本院临床分离的大肠埃希菌245株，标本来源主要为肺部感染患者的痰液，所有菌株均经过HX-21细菌鉴定药敏分析仪鉴定到种，-50℃保存。阴性质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，qnr阳性质控菌株为肺炎克雷伯，由杭州浙江大学医学院附属第二医院检验科周宏伟博士馈赠。
二、抗菌药物：哌拉西林、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢吡肟、头孢他啶、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素、亚胺培南、阿米卡星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因等购自杭州天和微生物试剂有限公司。
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三、1.培养基：M-H肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、血琼脂培养基、巧克力琼脂培养基均购于天津金章科技发展有限公司。
2.药敏试验试剂：无菌生理盐水、蒸馏水、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)、0.5麦氏标准比浊管(相当于1.5×108 cfu/ml)
四、方法
1.采用肉汤稀释法测抗菌药物的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，计算其MIC50和MIC90。依据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的标准判断药敏结果。
2.ESBLs确证试验： 用头孢噻肟、头孢噻肟-克拉维酸和头孢他啶、头孢他啶-克拉维酸纸片法做确证试验，结果判断依据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的标准。凡是含克拉维酸与不含克拉维酸的纸片抑菌环直径相差≥5 mm则确认为产ESBLs菌株。
3.qnr基因扩增与测序：采用菌落PCR方法，将分纯的菌落直接沾到PCR体系中进行扩增，引物设计及扩增长度见表1，配制50 μl反应体系：含上、下游引物各1 μl，10×buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl2 3 μl，Tap酶0.5μl，dNTP 1 μl，模板5 μl，双蒸水33.5 μl。PCR循环条
件为94℃预变性5 min；94℃30 s，50℃ 40 s，72℃ 40 s，循环30次，最后72℃延伸5 min。取PCR产物10 μl，用含有10 mg/ml溴乙锭的1%琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液中100 V电泳30 min，用UVLslav凝胶成像系统分析PCR产物。将PCR阳性产物送上海生工生物有限公司进行测序。
结 果
一、药敏实验结果 亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦显示良好的抗菌作用，其MIC50分别为0.5 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml，MIC90均为2 μg/ml。其他药物均表现出不同程度的耐药。
汽化二、产ESBLs检测结果 245例大肠埃希菌中，检出产ESBLs菌株107例，占43.7%。产ESBLs菌株对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类耐药率均高于非产ESBLs菌株。
三、qnr基因检测及测序结果 在245株大肠埃希菌中共检出5株携带qnrB基因，1株携带qnrS基因，未检出qnrA基因，测序结果在GenBank上进行同源性比较，其中qnrB基因核苷酸序列与注册号为DQ303920.1的qnrB3基因序列同源性为99%, qnrS基因核苷酸序列与注册号为EU391634.1的qnrS1基因序列号同源性为92%。
表1 PCR扩增引物序列及扩增长度基因引物名称引物序列扩增长度(bp)qnrAqnrA⁃P15’⁃GGGTATGGATATTATTGATAAAG⁃3’661qnrA⁃P25’⁃CTAATCCGGCAGCACTATTA⁃3’qnrBqnrB⁃P15’⁃GATCGTGAAAGCCAGAAAGG⁃3’469qnrB⁃P25’⁃ACGATGCCTGGTAGTTGTCC⁃3’qnrSqnrS⁃P15’⁃ACGACATTCGTCAACTGCAA⁃3’417qnrS⁃P25’⁃TAAATTGGCACCCTGTAGGC⁃3’
表2 15种抗菌药物的MIC50及MIC90抗菌药物MICrange(μg/ml)MIC50(μg/ml)MIC90(μg/ml)哌拉西林8-512256256头孢呋辛4-51264256头孢哌酮8-51264256头孢吡肟2-2561664头孢他啶2-2561664氨曲南1-2563264哌拉西林/他唑巴坦0．25-412头孢哌酮/舒巴坦0．25-40．52庆大霉素1-2561632亚胺培南0．25-20．52阿米卡星0．5-25616128环丙沙星0．5-5121664氧氟沙星0．5-2561664左氧氟沙星0．25-2561664呋喃妥因0．5-2561632
讨 论
近年来，大肠埃希菌的耐药性日趋严重，及时了解其耐药性，能为临床合理选用抗生素提供依据。大肠埃希菌产ESBLs菌株的出现，给临床抗菌上带来很大困难。质粒介导的ESBLs的产生是造成大肠埃希菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制之一。据报道，携带编码ESBLs的质粒的菌株往往可同时携带氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物等的耐药基因，从而呈现多重耐药[1]。
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本研究显示：临床分离大肠埃希菌不仅对头霉素类、喹诺酮类药物呈高度耐药，且对青霉素类、庆大霉素类、四环素类等抗菌药物耐药显著，呈多重耐药性，说明这些药物不适合我院作为大肠埃希菌感染的选用药物，目前仅对碳青酶烯类及酶抑制剂类抗菌药物敏感，但随着这类药物的广泛应用，势必会使其敏感性下降，故应加强监测。本次资料显示产ESBL株大肠埃希菌，占43.7%，高于张秋桂[2]报道的22.2%和吴敏等[3]报道的17.5%。国内报道大肠埃希菌临床分离株中ESBLs主要以CTX-M基因型为主[4]，其特征是对头孢噻肟的水解能力较强而对头孢他啶的水解能力较弱，因此药敏试验中产生此酶的菌株常对头孢噻肟耐药而对头孢他啶敏感[5]，本研究同样也证实了这一点。
细菌对喹诺酮药物的耐药机制比较复杂, 长期以来一直普遍认为喹诺酮类药物的耐药主要是由染体介导，qnr基因的发现，拓宽了这一耐药机制。qnr基因是由质粒介导的喹诺酮类耐药基因，其作用机制是其编码的蛋白质Qnr对喹诺酮类药物作用靶位的保护从而导致药物失败[6]。这种新的细菌耐药机制称为质粒介导的喹诺酮类抗菌药物耐药(plasmid-mediated quinolone resistance，PMQR)。本次研究，5株细菌中检出qnrB基因，1株检出qnrS基因，未检出qnrA基因，这与其他地区的检出结果有一定差距，可能与本地区临床医生的用药习惯有关。此6株qnr基因阳性菌株均为产ESBLs菌株，且为多重耐药，间接证明
了携带编码ESBLs的质粒同时携带喹诺酮耐药基因这一理论。
表3 产ESBLs和非产ESBLs的大肠杆菌对15种抗菌药物耐药性的比较[株(%)]抗菌药物产ESBLsRIS非产ESBLsRIS哌拉西林106(99．1)1(0．9)0101(73．2)33(23．9)4(2．9)头孢呋辛95(88．8)10(9．3)2(1．9)90(65．2)45(32．6)3(2．2)头孢哌酮101(94．4)1(0．9)5(4．7)95(68．8)41(29．7)2(1．5)头孢吡肟56(52．3)40(37．4)11(10．3)37(26．8)66(47．8)35(25．4)头孢他啶58(54．2)42(39．3)7(6．5)49(35．5)22(15．9)67(48．6)氨曲南69(64．5)22(20．6)16(14．9)56(40．6)27(19．6)55(39．8)哌拉西林/他唑巴坦00107(100)00138(100)头孢哌酮/舒巴坦00107(100)00138(100)庆大霉素87(81．3)11(10．3)9(8．4)50(36．2)28(20．3)60(43．5)亚胺培南00107(100)00138(100)阿米卡星29(27．2)39(36．4)39(36．4)22(16．0)14(10．1)102(73．9)环丙沙星100(93．5)2(1．9)5(4．6)89(64．5)30(21．7)19(13．8)氧氟沙星96(89．7)9(8．4)2(1．9)85(61．6)20(14．5)33(23．9)左氧氟沙星90(84．1)1(0．9)16(15．0)80(58．0)40(29．0)18(13．0)呋喃妥因4(3．7)3(2．8)100(93．5)2(1．5)5(3．6)131(94．9)
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