收稿日期:2019-12-18 修回日期:2020-04-22基金项目：国家科技支撑计划(N o .2015B A K 44B 00) *通讯作者：罗云敬，女，教授，博士研究生导师，主要从事分子毒理学与癌症防治方面研究㊂E -m a i l :l u o y j @b j u t .e d u .c n 第36卷第6期V o l .36 N o .6分析科学学报J O U R N A LO FA N A L Y T I C A LS C I E N C E 2020年12月D e c .2020
D O I :10.13526/j .i s s n .1006-6144.2020.06.008展青霉素分子印迹聚合物的合成表征及其
闫士华，谢子奇，张露晓，罗云敬*(北京工业大学生命科学与生物工程学院，环境与病毒肿瘤学北京市重点实验室，北京100124
)摘 要：采用本体聚合法制备了展青霉素(P a t u l i n ,P A T )分子印迹聚合物(M I P s )，其中替代模板分子为2-吲哚酮，功能单体为4-乙烯基吡啶，交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯，致孔剂为乙酸乙酯㊂使用扫描电子显微镜对P A T -M I P s 进行表征,
结合平衡吸附试验等表明:M I P s 对P A T 具有特异性吸附作用㊂以P A T -M I P s 为吸附填料制备分子印迹固相萃 取柱，结合高效液相谱法能快速检测苹果汁样品中P A T 的残留, 其线性范围为0~50m g /L (R 2=0.9992)，相对标准偏差(R S D )为1.92%，苹果汁样品加标回收率为78.2%~90.1%㊂本文所建立的方法可用于复杂基质实际样品中P A T 残留的检测㊂关键词：真菌毒素；展青霉素；分子印迹聚合物；高效液相谱；固相萃取
中图分类号:O 657.7+2 文献标识码:A 文章编号:1006-6144(2020)06-821-06
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展青霉素(P a t u l i n ,P A T )
是常见的真菌毒素之一，其毒性极强且分布范围广[1]，在世界各地的多种食品中均不同程度检测到P A T [2,3],
于霉变的水果中尤其常见，严重威胁着人们的健康㊂体外实验表明[4,5],P A T 可诱导多种菌株的基因突变，对体外培养的细胞亦有D N A 损伤作用；动物实验研究也发现P A T 对
多种器官有明显的毒性[6,7]㊂我国国家标准(G B2761-2017)‘食品中真菌毒素限量“规定苹果汁等食品中P A T 限量为50μg /k g [8]㊂由于P A T 的高毒性，各国学者对其灵敏和准确的检测方法给予高度关注，但是P A T 检测仍然有一些问题存在:
微乳液电动谱法准确度较低[9]㊁酶联免疫法操作繁琐[10]㊁超高效液相谱-串联质谱法(U P L C -M S /M S )成本高昂[11]等㊂高效液相谱(H P L C )结合紫外法检测食品中的P A T ，因简单且准确于2016年纳入中国食品安全国家标准[12]㊂然而，利用H P L C 法检测实际样品中的
P A T 时,5-羟甲基糠醛(5-HM F )因结构及化学性质类似[13]，对其检测的准确性和灵敏性造成影响，更何况实际样品中组分较多，目标分析物极易被干扰㊂
近年来，食品中P A T 检测样品前处理方法主要有分散固相萃取法[14]㊁固相萃取法[15]㊁多功能净化柱法[16]等㊂固相萃取法是较为常用的方法，但传统的吸附材料无法对P A T 进行特异性捕捉,
限制其应用㊂吕伟超等[17]采用自制固相萃取柱联用超高效液相谱检测P A T ，谱杂峰多㊂分子印迹聚合物(M I P s )技术与固相萃取(S P E )技术结合可望解决上述问题，这是基于M I P s 有特定结构的孔穴,
能特异性结合目标物分子，因而有很高的专一性与准确度㊂本研究以P A T 类似物2-吲哚酮为替代模板，采用本体聚合法合成了具有特异性的P A T -M I P s ，并以此为填料制备了固相萃取小柱，联用H P L C 法分析了苹果汁复杂基质中的P A T 含量㊂
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
e 2695型高效液相谱，沃特世公司;S H Z -D (Ⅲ)
循环水式多用真空泵，上海科升仪器有限公司㊂1
28
第6期闫士华等：展青霉素分子印迹聚合物的合成表征及其在苹果汁检测中的应用第36卷展青霉素(P A T)㊁4-乙烯基吡啶(4-V P)㊁2-吲哚酮(O x i n)㊁偶氮二异(A I B N)㊁3-氨丙基三乙氧基
硅烷(A P T E S)㊁甲基丙烯酸(MA A)㊁丙烯酰胺(AM)㊁二甲基丙烯酸乙二醇酯(E G D MA)，均购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;5-羟甲基糠醛(5-HM F，上海安谱科学仪器有限公司)；乙腈(谱纯，德国M e r c k公司)；无水N a A c㊁乙酸乙酯㊁冰H A c(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)㊂实验用水为去离子水㊂1.2H P L C条件
谱柱:Sμn F i r e R M C18柱(150m mˑ4.6m m,5μm)，流动相：乙腈ʒH A cʒ水=5ʒ0.5ʒ94.5(V/V/V)；等度洗脱；流速1m L/m i n㊂柱温30ħ；检测波长276n m；进样体积10μL㊂
1.3P A T-M I P s的制备
准确称取0.6658g替代模板O x i n溶解在25m L的乙酸乙酯中，加入2.146m L的功能单体4-V P㊂超声15m i n，常温静置孵育6h㊂加入0.25g引发剂A I B N和3.95m L交联剂E G D M A㊂超声脱气15m i n，充入氮气15m i n,60ħ下水浴24h㊂将所得的固体物质研磨，过分子筛㊂然后以乙酸乙酯为提取剂索氏提取12h，再以甲醇ʒ乙酸(9/1,V/V)混合液为提取剂索氏提取24h，最后以甲醇作为提取剂在索氏提取器上洗脱12h㊂最终将经过索氏提取的固体物质放入干燥箱中烘干24h㊂非印迹聚合物(N I P s)的制备在合成步骤上与M I P s相同，但不加模板分子㊂
1.4P A T-M I P s的静态吸附试验
分别称取5㊁10㊁20㊁30㊁40m g的M I P s和N I P s于离心管中，加入1.5m L的P A T标准溶液(20m g/L)㊂将离心管置于摇床上振荡60m i n，然后2000r/m i n高速离心3m i n，过0.22μm滤膜，利用H P L C法检测上清液中P A T的浓度，计算聚合物静态吸附百分比㊂
1.5P A T-M I P s的吸附动力学及印迹因子试验
分别称取10m g的M I P s和N I P s于离心管中，再加入1.5m L的P A T标准溶液(20m g/L)㊂将离心管置于摇床上振荡(时间范围为0~60m i n，梯度为15m i n)，然后以2000r/m i n高速离心3m i n，过0.22μm滤膜，利用H P L C法检测上清液中P A T的浓度，计算出各个样品的吸附容量㊂根据饱和吸附容量计算聚合物的印迹因子(I m p r i n t i n g F a c t o r,I F)[18]㊂
成长的步伐
1.6分子印迹固相萃取小柱的制备
在5m L聚丙烯固相萃取空柱中均匀填入200.0m g制备的M I P s，分别在聚合物上下两侧加盖聚乙烯筛板，填充均匀，用玻璃棒轻轻压实，得到柱压适当的分子印迹固相萃取(M I S P E)小柱㊂
1.7样品前处理及M I S P E过程
在10m L离心管中精确移取1.5m L苹果汁样品，加入100μL的P A T标准储备液(200m g/L)，再加入乙酸乙酯5m L，混匀㊂超声5m i n，使苹果汁中的P A T被完全萃取㊂静置5m i n，移取上清液于洁净离心管中㊂在40ħ条件下用氮气吹干离心管中的乙酸乙酯，再加入5m L乙酸盐缓冲液复溶，以待后续净化㊂
向M I S P E小柱中按序加入3m L甲醇和3m L水进行活化处理，再加入5m L复溶的溶液上样，最后加入3m L去离子水淋洗㊂排净小柱中的液体后，加入3m L乙酸乙酯作为洗脱液洗脱柱中吸附的P A T㊂收集洗脱液,40ħ氮气吹干㊂加入1m L流动相复溶，过0.22μm滤膜，利用H P L C法检测㊂
2结果与讨论
2.1制备条件的优化
2.1.1模板分子的优化控制其他条件不变，以P A T结构类似物2-羟基烟酸(2-H N A)和O x i n为替代模板分子制备聚合物并比较其吸附性能㊂结果如图1所示，以O x i n为模板分子制备的M I P s吸附效果优于2-H N A，因此选择O x i n为替代模板㊂
2.1.2反应溶剂的优化M I P s制备过程中，反应溶剂的选择不仅影响了聚合反应的发生，也影响着M I P s的性能㊂控制其他条件不变，分别选用甲醇㊁乙酸乙酯和乙腈三种溶剂作为反应溶剂制备M I P s，比较聚合物的吸附性能㊂不同溶剂制备的M I P s吸附性能排序依次为：乙酸乙酯>甲醇>乙腈㊂乙酸乙酯作为反应溶剂时制备的M I P s对P A T吸附容量可达630μg/g，显著高于其他溶剂(P<0.05)，且乙酸乙酯安全性最好，因此选择乙酸乙酯作为反应溶剂进行后续实验㊂
2.1.3功能单体的优化分别以A P T E S㊁4-V P㊁MA A及AM作为功能单体制备P A T-M I P s，将制得的228
第6期分析科学学报第36卷聚合物作为吸附剂，用P A T 标准溶液进行平衡吸附实验得到各个样品的吸附容量，以A P T E S 和4-V P 为功能单体制作的聚合物吸附性更好，两者差异不大(P >0.05)㊂再用P A T 和5-HM F 的混合标准溶液分别测定各个样品中P A T 与5-HM F 相对分配系数，结果如图2所示㊂4-V P 制作的聚合物选择性更好，选择性对预处理样品中P A T 的富集和高效检测有重要的影响，因此最终选择4-V P 作为功能单体㊂
图1 模板分子的优化F i g .1 O p t i m i z a t i o no f t e m p l a t em o l e c u l e s 图2 功能单体选择性的比较F i g .2 C o m p a r i s o no f t h e s e l e c t i v i t y o f f u n c t i o n a l m o n o m e r s
2.2 聚合物扫描电子显微镜(S E M )表征图3为P A T -M I P s (a )及N I P s (b )的扫描电镜(S E M )图㊂可以看出P A T -M I P s 表面较为粗糙,
形成了特定的疏松孔穴结构，说明模板分子已洗脱，存在的孔穴能够与目标分子相匹配，而N I P s 仍较为光滑,
结构紧实，没有能与目标分子结合的位点
㊂图3 P A T -M I P s (a )和P A T -N I P s (b )的扫描电镜(S E M )图(放大倍数为ˑ20.0K )F i g .3 S E Mi m a g e s o fP A T -M I P s (a )a n dP A T -N I P s (b )(M a g
n i f i c a t i o no fˑ20.0K )2.3 谱条件的选择
5-HM F 通常被认为是P A T 检测中的主要干扰物㊂按照1.2H P L C 条件测定P A T 和5-HM F 的混图4 混合标准工作液的H P L C 谱图(1-5-HM F ;2-P A T )F i g .4 H P L C c h r o m a t o g r a m o f m i x e ds t a n d a r d w o r k i n g s
o l u t i o n (1-5-HM F ;2-P A T )合标准工作液(10m g /L )，考察其分离情况㊂结果如图4所示,P A T 及5-HM F 分离度良好,
它们的保留时间分别为3.25m i n 和3.57m i n ㊂2.4 聚合物静态吸附分析
由图5可知，随着加入的M I P s 和N I P s 的质量增加,
M I P s 和N I P s 对于溶液中P A T 的吸附百分比逐渐增大;
但M I P s 的吸附百分比始终大于N I P s ，当投入的聚合物质量达到40m g 时,
M I P s 的吸附百分比(58.70%)近似于N I P s 吸附百分比(18.85%)的三倍，这证明了M I P s 中具有与目标物P A T 相匹配的孔穴结构，使M I P s 能够表现出优于N I P s 的吸附性能㊂2.5 吸附动力学及印迹因子聚合物的吸附动力学结果如图6所示，振荡前45m i n ,M I P s 对于P A T 的吸附容量随着时间的增加而增大，且M I P s 相比N I P s 有更高的吸附速率㊂振荡45m i n 时M I P s 吸附容量为898.0μg /g 达到最高点，之后趋平，因此45m i n 为饱和吸附时间，并以此为条件进行I F 的计算㊂
由表1可知，饱和吸附条件下M I P s 吸附目标物质P A T 的性能达到N I P s 的3.114倍，表明M I P s 对于P A T 具有特异性吸附的能力㊂
streambox vcr3
28
第6期闫士华等：展青霉素分子印迹聚合物的合成表征及其在苹果汁检测中的应用第36穆斯塔法
卷
图5 吸附性能评价F i g .5 E v a l u a t i o no f a d s o r p t i o n p e r f o r m a n c
e 图6 M I P s 和N I P s 的吸附动力学曲线F i g .6 A d s o r p
t i o nk i n e t i c s c u r v e o fM I P s a n dN I P s 表1 M I P s 与N I P s 的吸附性能比较
T a b l e 1 C o m p a r i s o no f t h e a d s o r p t i o n p r o p
e r t i e s o fM I P s a n dN I P s T a r g
e t s u b s t a n c e M I P s N I P s c b (μg /g )K d c b (μg /g )K d I F P A T 8260.587016230.18853.114
2.6 实际样品中P A T 残留的测定2.6.1 标准曲线与检出限 配制P A T 浓度分别为0㊁1㊁5㊁10㊁20㊁50m g
/L 的标准溶液，结合M I S P E -H P L C 测得P A T 液相谱图，线性方程为:y =53616x -17562(y 为P A T 峰面积,x 为P A T 浓度(m g /L )，相关系数R 2=0.9992)㊂在0~50m g
/L 范围内,P A T 的峰面积与浓度呈良好的线性关系㊂测定低浓度P A T 标准溶液并计算信噪比(S /N )，以信噪比为3确定的方法检测限为3μg /L ㊂方法的精密度(R S D )为1.92%㊂图7 未处理的苹果汁加标样品(a )㊁苹果汁加标样品乙酸乙酯提取(b )㊁苹果汁加标样品经乙酸乙酯提取及M I S P E 小柱净化(c )㊁苹果汁未加标经乙酸乙酯提取及M I S P E 小柱净化后(d )谱图F i g .7 C h r o m a t o g r a m s o f u n t r e a t e d s p i k e da p p l e j u i c e s a m p l e (a ),s p i k e da p p l e j u i c e s a m p l e a f t e r e t h y l a c e t a t e e x t r a c -t i o n (b ),s p i k e da p p l e j u i c e s a m p l ea f t e r e t h y l a c e t
a t e e x t r a c t i o na n d M I S P Ec o l u m nc a r t r i d g e p u r i f i c a t i o n (c ),a n du n -s p i k e da p p l e j u i c e s a m p l e a f t e r e t h y l a c e t a t e e x t r a c t i o na n dM I S P Ec o l u m n c a r t r i d g
e p u r i
f i c a t i o n (d )2.6.2 苹果汁中P A T 残留的检测 对苹果汁样品进行H P L C 法检测,
样品分别为：未处理的苹果汁加标样品(图7a )㊁苹果汁加标经乙酸乙酯提取样品(图7b )㊁苹果汁加标经乙酸乙酯提取及M I S P E 小柱净化
后样品(图7c )和苹果汁未加标经乙酸乙酯提取及M I S P E 小柱净化后样品(图7d )㊂未处理的苹果汁加标4
28
第6期分析科学学报第36卷样品存在十余种杂质峰，且基线不平，化学结构与P A T 极其相似的5-HM F 杂峰峰面积高㊂经乙酸乙酯提取后杂质峰减少，但5-HM F 仍有较高峰面积，为提取前93.2%㊂再经M I S P E 小柱净化后基线平整,5-HM F 峰明显降低，浓度仅为未经处理前13.70%,P A T 回收率为89.3%,
未加标的空白对照样品基线平稳，未检出P A T ㊂结果表明样品经过M I S P E 小柱净化处理后，样品基质中杂质的残留量得到了有效控制，该方法有效净化了样品基质中的非目标物杂质，有效实现P A T 选择性分离㊂2.6.3 加标回收率 取苹果汁样品，分别添加50㊁100㊁200μL 的P A T 标准储备液(200m g /L )，按照1.7方法处理,H P L C 法测定，每个水平重复4次，结果见表2㊂P A T 回收率在78.2%~90.1%之间,
相对标准偏差(R S D )在5%以内，表明P A T -M I P s 萃取结合H P L C 法能够有效地检测苹果汁中的P A T 含量㊂
表2 苹果汁中P A T 的加标回收率(n =4)T a b l e 2 R e c o v e r i e s o fP A Ts p i k e d i na p p l e j u i c e s a m p
l e s (n =4)S p i k e d (m g /L )F o u n d (m g /L )R e c o v e r y (%)R S D (%)P A T
107.4278.24.2
7.708.03
福建医科大学学报
8.1420
17.8389.33.818.6218.0216.984037.6490.14.136.1934.0636.273 结论
本实验成功制备了具有特异吸附性的P A T 分子印迹聚合物,
并以此为填料制备了固相萃取柱，结合H P L C 法检测了苹果汁中P A T 的含量㊂实验结果证明，该方法能有效降低苹果汁复杂食品基质中的5-羟甲基糠醛等干扰物干扰，可以消除十余种杂质峰，回收率达到78.2%~90.1%，选择性好，具有较高的应用价值，可为P A T 引起的食品安全检测提供有力的支撑㊂参考文献:
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