分泌系统就是其中之一。利用分泌系统，细菌可以获得营养、向外部环境分泌毒力因子以及直接靶向真核细胞使其致病。到目前为止，人们已在细菌中发现9套分泌系统(T1SS~T9SS)[1~2],2006年
由Pukatzki 等[3]研究小组命名的Ⅵ型分泌系统(type Ⅵsecretion system,T6SS)是近几年来研究较多的一种分泌系统。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeru-ginosa )包含进化上完全不同的3种基因簇H1-T6SS 、H2-T6SS 、H3-T6SS，这使铜绿假单胞菌成 转运机制的研究进展
收稿日期:2019-11-21；修回日期:2020-03-08
作者简介：王瑞营(1992—)，女，河南南阳人，硕士，主要从事病原微生物耐药机制的研究;*通信作者：扈会整(1977—)，女，河北保定人，硕士，副主任检验师，主要从事临床微生物与临床用药研究,Tel:************,E-mail:*****************。
王瑞营，张
娟，王
碧，侯亚文，吴斌艳，扈会整*
(陕西省核工业二一五医院检验科，中国陕西咸阳712000)
摘要：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa )是一种分布广泛的机会致病菌，临床上可引起急性或慢性感染。Ⅵ型分泌系统(type VI secretion system,T6SS)是铜绿假单胞菌中一种重要的分泌系统，不仅能分泌多种毒力蛋白至环境或真核细胞中，还能促进铜绿假单胞菌生物被膜的形成，在铜绿假单胞菌的致病性及耐药性中发挥重要作用。铜绿假单胞菌的T6SS 不仅可以转运毒性蛋白，还能够参与金属离子的转运，从而解除自身的环境压力及生存竞争。本文主要针对铜绿假单胞菌中T6SS 的结构组成、调控及其对铁离子的转运机制等方面的研究进行综述。
关键词：铜绿假单胞菌;Ⅵ型分泌系统(T6SS)；结构；调控；铁离子中图分类号:Q71
文献标识码:A
文章编号:1007-7847(2020)05-0404-06
Research Progress in the Type ⅥSecretion System of
Pseudomonas aeruginosa and Mechanism of Its Participation in
Transport of Iron Ions WANG Rui-ying,ZHANG Juan,WANG Bi,HOU Ya-wen,WU Bin-yan,
HU Hui-zheng *
(Department of Clinical Laboratory ,No .215Hospital of Shaanxi Nuclear Industry ,Xianyang 712000,Shaanxi ,China )
Abstract:Pseudomonas aeruginosa is a major opportunistic pathogen that can cause acute or chronic infec -tion in clinic.The type Ⅵsecretion system (T6SS)is an important secretion system that secretes a variety of virulence proteins into environment or eukaryotic cells and promotes the formation of envelope in P.aerugi 原nosa .T6SS plays an important role in the pathogenicity and drug resistance of P.aeruginosa .It can transport not only toxic proteins but also metal ions,thereby relieving the bacterial environmental pressure and sur -vival competition.Herein,the structure,regulation and Fe ion transport mechanism of T6SS in P.aeruginosa are discussed.
Key words:Pseudomonas aeruginosa ;type Ⅵsecretion system (T6SS);structure;regulation;iron ion
（Life Science Research ，2020，24（5）：404~409）DOI ：10.16605/jki.1007-7847.2020.05.
008
·综述·
第24卷第5期生命科学研究Vol.24No.52020年10月Life Science Research Oct.2020
. All Rights Reserved.
第5期王瑞营等：铜绿假单胞菌中遇型分泌系统及其参与铁离子转运机制的研究进展
为研究T6SS的理想模式生物[4~5]。
铜绿假单胞菌又称绿脓杆菌，是一种常见的
人类机会致病菌，在人中可以引起严重的急性
和慢性感染[6]。铜绿假单胞菌的易感人主要有烧伤、经器官移植术、呼吸道感染等免疫力低下患
者，尤其在囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)患者中,
该菌感染是主要的致死原因[7]。铜绿假单胞菌的特定生活方式使其对抗生素的抗性增加，给临床
带来很大困难。我院收集的数据显示,2016
年9月至2019年8月铜绿假单胞菌耐碳青霉烯
南京321计划类抗生素的比率明显升高(表1)。T6SS在铜绿假
单胞菌的致病过程中扮演了重要的角，它通过
复杂的类似噬菌体尾部结构的分泌装置分泌效应
蛋白并将其直接注入宿主细胞内[8]，引起宿主细胞相应的病理性变化。鉴于T6SS在铜绿假单胞菌
中的重要性，目前越来越多的科研人员致力于其
致病性的研究，同时针对该系统的小分子抑制剂
及疫苗的研发也为控制和预防铜绿假单胞菌的感
痰浊
染提供了新的手段。本文结合最近几年铜绿
假单胞菌中T6SS的最新研究成果及我们课题组
的研究工作，阐述了T6SS的结构、调控及其参与
铁离子的转运机制。
1T6SS的结构、装配及分泌
1.1T6SS的结构
研究指出，在所有测序的革兰氏阴性菌中,
将近25%的细菌具有编码T6SS的基因簇，其中
就包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、弧菌(Vi-brio cholerae)、不动杆菌属(Acinetobacter)等[9]。T6SS 的基因簇在不同物种间的组成成分略有差异，但其13个保守基因的编码产物(TssA~TssM)是T6SS 发挥正常功能所必需的，因此不同病原菌的T6SS 在电子显微镜下具有相似的结构，它是一种复杂的收缩注射系统[10~13]。根据功能的不同，铜绿假单胞菌中T6SS的结构蛋白大致可以分为三类。第一类是与跨膜结构相关的蛋白质，包括TssL、TssM及脂蛋白TssJ等，这些蛋白质相互作用形成横跨整个细胞膜的复合体；第二类是与类噬菌体尾部结构相关的蛋白质，它们根据功能的不同又可以分为3组:1)噬菌体注射器样结构相关的蛋白质。该组蛋白质由溶血素共调节蛋白(hemo-
lysin co-regulated protein,Hcp)和缬氨酸-甘氨酸重复蛋白(valine glycine repeat protein G,VgrG)组成，其中Hcp形成尾管结构(类似T4噬菌体尾管蛋白质gp19[14]),VgrG形成细胞穿刺的尖端(与T4噬菌体尾部尖端蛋白质类似)。此外,Hcp-VgrG结构的末端还有一个类似针头的脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸重复蛋白(proline-alanine-alanine-argi-nine,PAAR)，使注射器样的结构更加稳定、尖锐[15];
2)噬菌体尾鞘样结构相关的蛋白质。该组蛋白质由TssB/TssC亚基组成，亚基与噬菌体蛋白质gp18高度相似，其在Hcp管的周围形成管鞘，通过管鞘的收缩将“注射器样结构”射至靶细胞表面，从而穿刺靶细胞的细胞膜，将效应蛋白注入胞内[16];
3)噬菌体基板样结构相关的蛋白质。该组蛋白质主要包括TssA、TssE、TssF、TssG和TssK等，形成与噬菌体gp25类似的基板样结构[17]；第三类是装置中负责能量供应的蛋白质，主要是ClpV(casei-nolytic protease V)。ClpV是一种具有腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatase,ATPase)活性的保守成分，对Hcp、VgrG及其同源蛋白底物的分泌至关重要[18]。T6SS的结构模型[19]详见图1。
1.2T6SS的装配及分泌
T6SS是一种特殊的大分子蛋白质输出装置，目前一些研究认为T6SS中噬菌体样的注射装置可能是在一些外界因子(如竞争性菌、铁离子浓度、营养物质等)的刺激下被激活的，这样注射装置是如何装配的就显得尤为重要[20]。有研究认为,T6SS 注射装置被激活时，首先,TssM、TssL和TssJ形成跨膜结构，
为接下来基板复合体的组装提供平台；其次,TssA、TssE、TssF、TssG和TssK形成基座部分,VgrG、PAAR及效应蛋白被招募到基座复合物上，从而稳定整个复合物；随后,Hcp蛋白以VgrG 三聚体为聚合起点形成跨膜的尾管结构；最后, TssB-TssC随着Hcp管的延伸而聚合到其外围，从而完成整个装配过程[19]。整个过程主要由ClpV
表12016—2019年我院铜绿假单胞菌的耐药率
Table1The drug resistance rates of P.aeruginosa in our hospital from2016to2019
Time 2016.09—2017.08 2017.09—2018.08 2018.09—2019.08Total strain number
2351
2536
3117
P.aeruginosa number
203
242
200
Drug-resistant strain number(carbapenem-resistant)
19
38
50
Drug resistance rate/(%)
9.36
15.70
25.00
405
.
com. All Rights Reserved.
生命科学研究
赞助支出圆园20年
图1T6SS 的结构和机理示意图(改编自参考文献[19])
TssJLM 形成跨膜结构;TssAEFGK 形成基座;Hcp 形成尾管结构;TssBC 在Hcp 管周围形成管鞘;VgrG-PAAR 形成穿刺尖端;ClpV 水解ATP 为整个分泌装置供能。
Fig.1Schematic representation of the structure and mechanism of the T6SS (adapted from reference [19])
TssJLM forms a transmembrane structure,TssAEFGK forms a base,Hcp forms a tail tube structure,TssBC forms a sheath
around Hcp,VgrG-PAAR forms a puncture tip,and ClpV hydrolyzes ATP to power for the entire secretion system.
水解ATP 提供能量。相关研究报道，铜绿假单胞
菌中T6SS 的分泌具有与噬菌体注射遗传物质类似的方式[9]。利用ClpV 水解ATP 释放的能量，噬菌体样尾鞘结构收缩，引起Hcp 管向细胞外延伸，使VgrG-PAAR “针头”样结构刺穿靶细胞[21]，此时效应蛋白通过与Hcp 、VgrG 或PAAR 特异性结合而被输送到靶细胞内[22]。当一轮分泌过程完成后,ClpV 蛋白将部分尾鞘和Hcp 管解聚，剩余未被注射的Hcp 管状物和基座复合物则在下一轮注射过程中被持续利用[19,23]。
2铜绿假单胞菌T6SS 的调控
在铜绿假单胞菌中T6SS 受到很多因素的调控，包括体感应系统(quorum sensing system,QSS)、铁吸收调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)、RsmA (regulator of secondary metabolites A)等。2.1QS 系统对T6SS 的调控
铜绿假单胞菌在转录水平上的表达受到QS 系统的调节。铜绿假单胞菌QS 系统至少包括4种子系统：外源信号酰基高丝氨酸内酯(acylho-moserine lactone,AHL)依赖的las 系统和rhl 系统;
烷基喹诺酮[2-alkyl-4(1H )-quinolone,AHQ]信号依赖的pqs 系统；非核糖体肽合成酶基因簇amb 原BCDE 编码的iqs 系统[11,24~25]。QS 系统的las 系统、rhl 系统和pqs 系统共同参与调控铜绿假单胞菌
毒力因子的释放、生活方式的适应性改变等。
已有研究表明QS 系统能够调控铜绿假单胞菌中T6SS 相关基因的表达，但对3种不同T6SS 基因簇的调控存在一定的差异。Lesic 等[26]研究发现,H1-T6SS 的基因表达受pqs 系统转录调节因子MvfR (multiple virulence factor regulator)和las 系统转录调节因子LasR (transcriptional regulator)的负调控；而H2-T6SS 和H3-T6SS 的基因表达受到LasR 和
MvfR 的正向调控。
此外，部分H3-T6SS 的表达需要MvfR 调节子的关键成分PqsE (Pseudomonas quinolone signal E)参与，而H2-T6SS 的表达不需要PqsE [27~28]。
2.2Fur 对T6SS 的调控
铁作为必需的微量营养素，对细菌的生长是必不可少的[29]，但当胞内的铁过量时,Fe 2+在过氧化氢存在的条件下产生活性氧(reactive oxygen spe-cies,ROS)，破坏细胞的基本成分，而细菌可通过第一线集团
真空浸漆Effectors
PAAR Hcp
VgrG Internal membrane
Target cell
Outer membrane
Peptidoglycan P.aeruginosa
TssJLM
TssAEFGK TssBC
ClpV
ATP
ADP+Pi
406
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第5期
Fur调控菌体内铁离子代谢的平衡，因此Fur对细菌生长和防止铁毒性起重要作用[30]。除了在调节铁稳态中的作用外,Fur还参与细菌许多毒力基因的表达。铜绿假单胞菌H2-T6SS启动子区域存在两个Fur基因盒，当外界环境中有铁存在时, Fur阻止RNA聚合酶与-10区结合，从而抑制H2-T6SS相关基因的转录；当铁受限制时,H2-T6SS基因受Fur的调控并表达，最终增强其对靶细胞的致病性[31]。
2.3RsmA对T6SS的调控
双组分系统(two-component system,TCS)信号传导途径是细菌和古细菌中的主要信号传导机制，它们利用TCS途径来监测关键的外部和内部刺激(包括营养物水平、离子和气体浓度、温度、氧化还原状态和细胞密度等)，并将这些信号转化为适应性反应。T6SS分泌系统的分泌及相关毒力基因的表达由一对通过GacSA-RsmY/Z-RsmA级联通路作用的双组分传感器激酶RetS(regulator of exopolysaccharide and typeⅢsecretion)和LadS(lost adherence sensor)协同调节[32],RsmA作为此通路中的关键调控因子对铜绿假单胞菌的T6SS分泌及生物膜的形成具有负向调控作用，并与铜绿假单胞菌急性感染和慢性感染持续性相关的多种毒力表型密切相关[33~34]。在这一调控过程中,LadS引起通路的关键调控因子——
—游离的RsmA浓度降低,RetS则发挥截然相反的调控作用。因此,RetS 和LadS能够分别通过GacSA-RsmY/Z对RsmA 进行间接调控，进而影响铜绿假单胞菌T6SS的分泌。
3T6SS参与铁离子的转运
铁作为酶、调节蛋白和参与新陈代谢信号传导的蛋白质复合物的组分，在许多细菌的生命活动中发挥重要作用。金属离子可以通过被动扩散穿过细胞膜，但是革兰氏阴性菌必须通过主动运输系统将稀有的金属离子转运至细胞内，以满足细胞的需求[35~36],T6SS在其中就扮演了重要的角。当受到外界刺激时，细菌通过T6SS分泌效应蛋白到细胞外，协助胞外的金属离子通过细胞外膜蛋白进入周质，再进一步通过内膜的转运蛋白运至胞内[27,37~38]。
Shen等[27]在缺铁培养基中筛选生长缺陷的铜绿假单胞菌突变株时发现,H3-T6SS附近的PA2374(Pseudomonas aeruginosa2374)基因(也称作tseF)与已知的铁获取系统[39~41]具有协同作用。然而TseF作为T6SS的底物，研究中并没有检测到其与铁离子之间的相互作用。那么，铜绿假单胞菌是否分泌了其他分子来参与铁离子的吸收？该研究团队通过蛋白质体外结合实验(pull down实验)发现，谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-trans-
ferase,GST)-TseF蛋白可以与铜绿假单胞菌培养上清液中的某些分子相互作用，而且液相谱-质谱(LC-MS)分析显示该分子为PQS(Pseudomo-nas quinolone signal)；敲除产生PQS信号相关的基因pqsA和pqsH后，突变体的上清液与GST-TseF蛋白不再有相互作用，证明PQS与TseF确实有相互作用；在进一步的生长实验中,tseF的缺失使Fe3+结合的PQS(PQS-Fe3+)不能提供铜绿假单胞菌生长所
美国纳斯达克需的铁，而Fe3+的加入使PQS与TseF 有更强的相互作用，说明tseF促进铜绿假单胞菌从PQS-Fe3+中吸收铁。铜绿假单胞菌的外膜囊泡(outer membrane vesicle,OMV)含有大量PQS分子[42]，研究显示，从△tseF纯化出的OMV蛋白中存在TseF，但△tseF△pqsH不表达TseF，这表明TseF 与OMV的关联是以PQS依赖的方式发生的[27]。这些结果表明，分泌的TseF被嵌入OMV中，再与铁结合的PQS相互作用，将金属离子转运至细胞表面的受体上。
铁离子是如何通过复合体进入细胞的？铜绿假单胞菌表面是否存在受体蛋白可以传递铁离子？相关研究采用pull down实验、质谱分析确定TseF与铁载体(Fe3+-pyochelin)受体同源性的FptA[43]和毒力有关的孔蛋白OprF均有相互作用[27]。为了验证TseF的结合靶点,Shen等[27]创建了突变体菌株PA△3Fe△tseF△fptA△oprF，然而该突变体只有当TseF和其中一个受体蛋白同时表达时，才能利用PQS-Fe3+作为唯一的铁源促进生长。
综上所述可知,TseF作为T6SS的底物，通过与PQS-Fe3+作用直接结合OMV，随后与受体蛋白FptA和孔蛋白OprF相互作用，促进Fe3+向细胞内输送[27]。图2简单整理了铜绿假单胞菌中T6SS 参与铁离子转运的机制。
目前，铜绿假单胞菌中关于T6SS参与其他金属离子转运的研究还没有被报道，但是已有研究发现在其他细菌中也存在类似的转运机制。在假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)中，人们发现存在与铁载体类似的螯合化合物来转运Zn2+，这一发现揭示了T6SS通过竞争基本物质和
王瑞营等：铜绿假单胞菌中Ⅵ型分泌系统及其参与铁离子转运机制的研究进展407 . All Rights Reserved.
生命科学研究2020年
图2铜绿假单胞菌中T6SS 参与铁离子转运的示意图(改编自参考文献[27])
TseF 通过T6SS 分泌至胞外，与含有PQS-Fe 3+的OMV 结合，随后细胞表面受体FptA 或OprF 对TseF 进行识别，进而促进铁向细胞内转运。
Fig.2Schematic representation of T6SS involved in iron ion transport in P.aeruginosa (adapted from reference [27])TseF is exported by T6SS and binds to OMV containing PQS-Fe 3+.Recognition of TseF by the cell surface receptor FptA or O -prF would facilitate the transport of iron into the cell.减少ROS 来增强细菌适应性方面的功能[37]；在伯克霍尔德菌(Burkholderia thailandensis )中,Shen 等[37]提出了由TonB 依赖性外膜转运蛋白MnoT 和T6SS 效应子TseM 介导的Mn 2+跨外膜主动转运模型，并发现T6SS 对伯克霍尔德菌在氧化应激条件下的生存具有重要意义[38]，这为我们进一步研究铜绿假单胞菌提供了参考。我们课题组前期利用蛋白质质谱技术对H2-T6SS 的分泌组进行了分析，结果显示H2-T6SS 分泌103种蛋白质，其中包括Cu 2+结合蛋白Azu 。为了探究H2-T6SS 与Cu 2+之间的转运机制，我们通过实验发现了H2-T6SS 和Azu 的转录调节子CueR，并揭示了在CueR 的调控下H2-T6S
S 通过分泌效应因子Azu 参与对Cu 2+的吸收。那么Azu 是如何将Cu 2+转运至胞内的呢？铜绿假单胞菌的外膜上也存在多种转运蛋白，其是否也跟伯克霍尔德菌一样，存在一种TonB 依赖性外膜转运蛋白，将Cu 2+转运至胞内？相关问题还需要进一步研究。
4小结与讨论
铜绿假单胞菌是一种能引起多部位急慢性感染且难以用抗生素控制的机会致病菌，拥有多种
致病机制和耐药机制。大量研究表明，铜绿假单胞菌通过T6SS 将毒力因子精准输送至宿主细胞是其致病的关键[16~17,19]。本文重点阐述了T6SS 的结构组成、调控及其参与铁离子转运的机制，总结了T6SS 特殊的“注射器”结构不但可以分泌效应蛋白直接杀死竞争细胞，还可以通过转运金属离子竞争必需营养物质[18,22,44]，揭示了T6SS 在铜绿假单胞菌致病力中的重要作用。
近几年，铜绿假单胞菌的T6SS 已成为微生物学领域的研究热点，其结构和生物学功能研究已经取得了很大进展，但是仍然有许多亟待解决的问题。例如：铜绿假单胞菌中T6SS 识别靶细胞的分子机制是什么？T6SS 是否可以通过效应物转运其他的金属离子或分子？新的一项研究表明，在铜绿假单胞菌中,T6SS 的效应物TplE 通过与其同源免疫蛋白TplEi 相互作用而防止自身中毒，当在体外使用一种小分子化合物或肽作为TplE-TplEi 的抑制剂时，可诱导铜绿假单胞菌中毒和自溶[45]，该发现为新型抗生素的研发提供了新方法。基于此，我们可以试想在T6SS 通过效应物转运金属离子的过程中是否
也存在类似的作用方式。研究者可以从T6SS 效应蛋白的结构入手，结
OMV
OMV
Fe 3+
T6SS
I nternal membrane
O uter membrane P eptidoglycan
PQS-Fe 3+
FptA
OprF
Unknown transporter
TseF PQS 408
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