解密pH依赖性的BCS2类药物，如何建⽴体内外相关的溶出⽅法，以降低BE风 险？
✎序⾔
从理论上讲，BCS2类药是体内体外相关性最好的⼀类，然⽽事实却证明，BCS2类药物BE⼀次通过率是最低的，为什么呢？原因在于，我们建⽴的溶出⽅法并不能真正地反映药物在体内的崩解、溶出过程，对于pH值依赖型药物，这⼀现象尤为突出。为此，药事纵横翻译组特翻译了pH值依赖性弱碱性 BCS II类药物卡维地洛的溶解度和体外溶出⾏为研究⼀⽂，抛砖引⽟，望各位同仁取其精华，在⼀致性评价中少⾛弯路。 简介
低溶解性、⾼渗透物，即⽣物药剂学分类系统（BCS）II类药物的溶出是⼝服吸收的限速步骤（1-3）。弱碱性BCSII类药物卡维地洛（结构式见图1）在从胃液到肠液转运过程中，在不同pH值部位会表现出复杂的溶解度，如在胃部（较低pH值）有利于其解离和完全溶解（4），⽽到达肠液（较⾼pH）后，由于其较低的溶解度可能会产⽣沉淀（4,5）。卡维地洛是⾮选择性β受体阻滞剂/α-1阻断剂，⽤于轻度⾄严重充⾎性⼼⼒衰竭和⾼⾎压，其LogP 值为3.8，碱性 pKa为7.8（6），酸性pKa为15.0（ChemAxon软件计算）。
卡维地洛的溶解度呈pH值依赖性（7）。卡维地洛在胃部酸性pH值条件下通过电离的形式溶解。然⽽，在碱性pH值下，卡维地洛在远端⼩肠处可能发⽣沉淀的（6,8,9）。例如，Stillhart等⼈研究表明，有78.2-91.8％的卡维地洛以结晶或⽆定型形式沉淀（9）。由于其⽔溶性差，卡维地洛的⽣物利⽤度很低（10,11）。通过GastroPlus™ Simulation软件预测，卡维地洛的⼝服吸收约为45.9％（6）。
通常，BCSII类药物的溶出度受很多⽣理因素的影响，如胃肠液的pH值、离⼦强度、缓冲容量是影响药物释放的三⼤因素（2,12）。
空腹状态下，胃液的pH值为1.4-2.1，进⾷后，pH值⽴即增加⾄pH3.0-7.0（取决于⾷物组成）。胃液的离⼦强度约在0.051-0.151mol/L范围内，均值为0.095mol/L（13）。胃液在禁⾷状态下的缓冲容量为0.013-0.019M /ΔpH（14），进餐后约为0.028M /ΔpH（15）。
⼩肠内的pH值从⼗⼆指肠到回肠逐渐升⾼，范围为pH5.5-8.3，取决于具体部位及是否进⾷（1,14,16）。pH值的增加是由于胃酸中和胰腺所产⽣的碳酸氢根离⼦所致（1,12）。肠液的离⼦强度在0.070-0.166mol/L范围内（17）。⼈体肠液的缓冲容量在餐前和餐后分别为0.003和0.013M /ΔpH（18）。Kalantzi等⼈研究发现⼗⼆指肠的缓冲容量餐前为0.006M/ΔpH，餐后为0.018-0.030M /ΔpH（15）。
由于胃肠液的⽣理特性，如pH、离⼦强度、缓冲容量，会随⾷物的摄⼊或者不同位置⽽发⽣变化，因此，研究这些因素对弱碱性BCS II类药物在胃肠液中的溶解度和溶出⾏为的影响是很有意义的。本⽂的⽬的是以弱碱性BCS II类药物卡维地洛为例，研究其在模拟胃液和模拟肠液介质（pH为1.2-7.8）中的溶解度和溶出⾏为。此外，还研究了缓冲盐种类、离⼦强度、缓冲容量对Dilatrend速释⽚中卡维地洛的溶解度和溶出⾏为的影响。 桐城派散文这项研究有助于更好地理解弱碱性BCS II类药物卡维地洛在⽣理胃肠液pH范围内的溶解度和溶出⾏为，这将有助于我们了解这类药物在肠道内的溶出度和沉淀⾏为，并为建⽴体外-体内相关性的溶出⽅法提供指导。
材料和⽅法
1、材料
pdp
卡维地洛（纯度为100.3％、总杂质为0.1％）；
Dilatrend速释⽚（含25mg卡维地洛）（ROCHE Australia，lot＃M2049B01）；
磷酸⼆氢钠和磷酸氢⼆钠（Sigma-Aldrich，德国）；
磷酸⼆氢钾、氢氧化钠和氯化钠购⾃Riedel-deHaën（德国）；
醋酸购⾃ACROS（USA）；
三⽔醋酸钠购⾃Fluka（美国）；
盐酸（37%w/v）购⾃GFS Chemicals（美国）。
双蒸⽔使⽤GFL蒸馏装置制备（德国）。
所有化学试剂均为分析纯。
2、⽤于溶解度和溶出度研究的介质
本研究中使⽤的模拟胃液和模拟肠液如下：
模拟胃液的溶出介质：
（a）0.7％HCl（USP 38，pH 1.45）
（b）不含胃蛋⽩酶的模拟胃液（SGFsp，USP 38； pH1.2）
北京空调器厂（c）空⽩餐前状态模拟胃液（空⽩FaSSGF，pH 1.6）（19）
（d）空⽩餐后状态模拟胃液（空⽩FeSSGF，pH5.0）（20）
模拟肠液的溶出介质：
（a）不含胰酶的模拟肠液（SIFsp，USP26; pH6.8）
（b）0.05M磷酸盐缓冲液（pH 6.8）（21） （c）醋酸盐缓冲液（USP 28，pH 4.5）
模拟⼗⼆指肠液的溶出介质：
（d）空⽩餐前状态模拟肠液（空⽩FaSSIF，pH 6.5）
湖南大学移动图书馆英国的资产阶级革命（e）空⽩餐后状态模拟肠液（空⽩FeSSIF，pH 5.0）（22）
本⽂中的空⽩是指配制溶出介质时，不添加酶、表⾯活性剂或胆盐。
除了药典标准介质外，模拟肠液配制采⽤了pH 6.8磷酸盐缓冲液，并配制了不同的缓冲液浓度（6.25、12.5、25、50和100mM）以获得具有可变离⼦强度和缓冲容量的溶出介质。磷酸盐缓冲液（100mM，pH 6.8）是根据Sigma-Aldrich Buffer Reference Center配制的。⽆离⼦强度和缓冲容量
的双蒸⽔作为空⽩对照。pH7.2和pH7.8磷酸盐缓冲液也是根据Sigma-Aldrich Buffer Reference Center配制的，⽤于模拟回肠末端和模拟结肠的pH值。
本研究中⽤到的溶出介质的化学组成和理化性质（pH、离⼦强度和缓冲容量）见表I、II、III、IV。
3、溶出介质的理化性质
溶出介质的pH通过pH计测量，pH计在测量前需经校验。离⼦强度计算公式如⽅程（1）所⽰（25）。
4、溶解度研究
所有介质中卡维地洛的溶解度测定⽅法为：在已装有50ml介质的烧杯中加⼊过量的卡维地洛，将烧杯置于⽔浴振荡器上，速度为50rpm，温度为37℃±1℃。通过校正后的pH计监控介质的pH值，如有必要调节⾄初始值。经1、2、4、6、24h后，取溶液5ml，以3500rpm离⼼15min，取上清液并⽤介质稀释⾄适当浓度，采⽤UV法在285nm处采⽤标准曲线法测定供试品中卡维地洛的浓度。平⾏制备三份样品，SD应⼩于10%。
溶解度（Cs）与药物浓度（CD）的⽐值，Cs/CD⽤来表⽰漏槽条件（S值）。根据USP规定，S⼤于3即符合漏槽条件（26）。卡维地洛在各pH值下的离⼦性百分数通过Henderson-Hasselbalch⽅程（3）计算。
5. Dilatrend⽚中卡维地洛的含量测定
Dilatrend⽚中卡维地洛的含量采⽤UV测定。
⽅法为：取10⽚，研细，精密称取约相当于卡维地洛25mg的细粉适量，置100ml量瓶中，加双蒸⽔10ml、甲醇-1M盐酸（9:1）混合溶液70ml，超声处理30min，放冷，⽤甲醇-1M盐酸（9:1）混合溶液稀释⾄刻度。样品溶液采⽤3500rpm 离⼼15min，取上清液，⽤甲醇-1M盐酸（9:1）混合溶液稀释⾄合适的浓度，在285nm处测定吸光度，采⽤标准曲线法测定供试品中卡维地洛的浓度。平⾏制备三份样品。Dilatrend⽚已通过重量差异检查。
6. 溶出研究
采⽤已校验的溶出仪（⽅法2桨法）进⾏溶出测定。
转数为50rpm，介质体积为900ml，温度为37±0.5℃，在5、10、15、30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240min⾃动取样，⽤0.45µm滤膜滤过。为了考察聚⼄烯膜对卡维地洛的吸附，考察了卡维地洛粉末在
0.7％HCl（USP38，pH1.45）介质中的溶出情况，取样量与Dilatrend⽚相似，溶出该条件与Dilatrend⽚相似。结果表明，过滤前后卡维地洛没有明显损失，回收率⼤于99.0％。
为了考察辅料是否⼲扰，配制了混合辅料，包括蔗糖、乳糖、聚维酮、交联聚维酮、⼆氧化硅和硬脂酸镁。在
0.7％HCl（USP38，pH1.45）中进⾏了空⽩辅料考察，结果表明，在285nm波长处辅料⽆吸收，说明辅料⽆⼲扰。Dilatrend⽚中卡维地洛的溶出量通过标准曲线计算，溶出介质的pH值在整个试验过程中进⾏监控，曲线的相似性通过
相似因⼦f2进⾏评价，见公式（4）（28）。如果f2⼩于50，说明溶出存在显著差异，如果f2在50-100之间，说明溶出相似。
结果与讨论
1. 溶解度研究
卡维地洛在胃肠液⽣理pH值范围内50%~100%呈解离状态（见表V）。卡维地洛的⾼离解度，说明其与缓冲液中的阴离⼦成盐，这可能影响弱碱物的溶解度（10,11,29）。因此，选择有阴离⼦的缓冲系统（缓冲盐种类）对卡维地洛的体外溶出度研究可能是重要的。
根据图1结构式可知，卡维地洛中咔唑的NH基是的酸性的，pKa为15.0（经ChemAxon软件计算）是因为孤对电⼦对芳构化的影响。因此，咔唑的N-H键很弱，氢容易⽔解成为H+（酸性质⼦）。相反，
脂肪族仲胺是弱碱性的，pKa 为7.8（6），这是由于受到周围氧原⼦的电负性和两侧芳⾹环上烷基的膨松性影响。卡维地洛的电离模式具有两性特征（具有酸性和碱性部分），在酸性pH值介质中，脂肪族NH被离⼦化形成阳离⼦中⼼，⽽在碱性pH介质中，咔唑NH被离⼦化形成阴离⼦中⼼。这种两性特征反映了其溶解特征。
卡维地洛（固体）对热（80℃下14天）、湿热（40℃/75％RH下14天）和紫外可见光（1.3×106lxh）稳定，在这些条件下，降解产物⼩于0.05％。
卡维地洛溶液在酸性（0.1N HCl，60℃4⼩时）、碱性（0.1N NaOH，60℃4⼩时）、紫外可见光（1.3×106 lxh，⽔）和热（60°C，⽔4 h）条件下，均没有⼤于0.06％的降解杂质产⽣（30）。
另有研究表明（31），卡维地洛固体和甲醇溶液在酸性溶液（1N HCl溶液，90℃6⼩时）、中性溶液（⽔，90℃6⼩时）和光解（UVC-254nm 30W灯，25℃7天）条件下，均⽆显著变化。但是，在碱性条件（1N NaOH，90℃，6⼩时）下会逐渐降解。
采⽤相同⽅法研究了卡维地洛在不同溶出介质（盐酸溶液，pH 1.2；酸性邻苯⼆甲酸酯缓冲液，pH 3.0；醋酸盐缓冲液，pH 4.5；磷酸盐缓冲液，pH 5.8、6.8、7.4）和⽔在37±0.5℃平衡24或48⼩时的溶解度（32-34）。样品在溶解度分析过程中未避光。卡维地洛在所有介质中的饱和溶解度见表VI。
pKa为7.8的卡维地洛表现出典型的弱碱物的pH值依赖性，即在低pH值时有较⾼的溶解度，在⾼pH值时有较低的溶解度。值得的注意是，卡维地洛的溶解度在酸性介质中（pH1.2-5.0）1⼩时内即达到饱和，但在碱性介质（pH 6.5-7.8）中卡维地洛的饱和溶解度出现在24⼩时后。在pH值 6.8时，卡维地洛的溶解度在磷酸盐浓度为25、50和100mM时⽐磷酸盐浓度为6.25和12.5mM时少了约37%。
在⾼离⼦强度（盐浓度）溶出介质中，卡维地洛的溶解度低，这表明溶解度随着离⼦强度的增加⽽降低（35,36）。在pH6.8介质中，尽管90%以上的卡维地洛以离⼦状态存在（见表V），但是由于形成了低溶解性的磷酸盐（10），显著降低了卡维地洛在这些磷酸盐缓冲液中的溶解度。卡维地洛在pH 7.2介质中溶解度⾮常低。在pH 7.8时，溶解度⽐pH 6.8时下降了90％。卡维地洛在⽆离⼦强度和⽆缓冲容量的双蒸⽔中的溶解度也⽐在pH6.8介质中的溶解度下降了约45%。
研究结果表明，卡维地洛在酸性介质中更易溶解。这说明脂肪族NH的碱性⽐咔唑NH的酸性更强，这决定了它的溶解度。因此，脂肪族NH的碱性⽐咔唑NH的酸性更强，促进其在醋酸盐缓冲液（pH4.5）中的溶解度。在酸性介质中的溶解度是优选的，特别是在空腹状态下的pH值1.6和4.5。较⾼的pH值导致溶解度降低，如在pH 6.8磷酸盐缓冲液中所⽰。总之，酸性介质是完全溶解卡维地洛的⾸选介质。
卡维地洛计算的溶解度（CS）和剂量（CD）的⽐率（S值）在所有介质中均⼤于3，这表明它们均满
⾜了漏槽条件。⽽S⼩于3，表明没有满⾜漏槽条件（见表VI）。卡维地洛在⼩肠内溶解度差，没有满⾜漏槽条件，说明了卡维地洛在⼩肠内沉淀。
2. Dilatrend⽚中卡维地洛的含量
Dilatrend⽚中卡维地洛含量为99.7±2.2%（n=3），含量均匀度在98.5%~100.5%之间（n=10）。
3. 溶出度研究
如图2所⽰，Dilatrend⽚剂中卡维地洛在酸性介质（0.7％HCl、SGFsp、空⽩FaSSGF和空⽩FeSSGF）为快速溶出，⼏乎可以重叠（f2>50）。溶出结果也与卡维地洛溶解度⼀致（表VI）。因此，在餐前和餐后，卡维地洛能够快速溶出。
卡维地洛在60min内能够完全溶出且达到平台，在0.7％HCl、SGFsp、空⽩FaSSGF、空⽩FeSSGF中，累积溶出量平均值分别为95.8%、97.2%、97.4％和98.2％。虽然空⽩FeSSGF 的pH值⽐0.7％HCl、SGFsp和空⽩FaSSGF⾼（分别为5.0对1.5、1.2和1. 6），但卡维地洛仍然能够溶出完全。这可能是由于空⽩FeSSGF中存在醋酸盐缓冲液形成⽔溶性醋酸盐的缘故（10）。由于溶出介质的pH值⽐较低，离⼦强度和缓冲容量的影响并不明显，进⼀步说明在酸性介质中，pH值是影响卡维地洛释放最重要的因素。
同空⽩FeSSGF⼀样，溶出介质的缓冲液组成对药物的溶出有明显影响，其中醋酸盐增加了溶出速率。如图3所⽰，卡维地洛在醋酸盐缓冲液中溶出速率⾮常快，5min为约39.2％，在15min时基本全部溶出（97.4％）。在pH 4.5醋酸盐缓冲液中，99.95％的卡维地洛呈质⼦化形式（表V）。Loftsson等⼈报道了质⼦化的碱与醋酸形成⽔溶性的盐，会导致溶解度增加（10）。因此，卡维地洛的溶出速率明显取决于溶出介质的pH值和缓冲盐种类。
空⽩FaSSIF（pH 6.5）与空⽩FeSSIF（pH5.0）的溶出曲线⽐较，空⽩FeSSIF溶出速率明显更快（f2=39.7）。然⽽在240min后，卡维地洛在两种介质中溶出量是相当的（约为86％）。卡维地洛在空⽩FeSSIF介质中溶出速率增加可以解释为它⽐空⽩FaSSIF有更低的pH值（5.0vs.6.5）。此外，Loftsson等⼈报道，空⽩FeSSIF中存在醋酸盐缓冲液会增加
释为它⽐空⽩FaSSIF有更低的pH值（5.0vs.6.5）。此外，Loftsson等⼈报道，空⽩FeSSIF中存在醋酸盐缓冲液会增加卡维地洛的溶解度（10），在空⽩FaSSIF中，NaCl和磷酸盐的存在导致形成不易溶解的盐酸盐和磷酸盐，从⽽降低了卡维地洛在空⽩FaSSIF中的溶出速率（10）。
在模拟肠液SIFsp和0.05M磷酸盐缓冲液（IntPh3）介质中，卡维地洛的释放量显著降低到70.2％和70.0％。卡维地洛的溶出曲线在SIFsp和0.05M磷酸盐缓冲液（IntPh3）中是相似的（f2>50），这表明不同种类的两种缓冲液对卡维地洛释放没有影响。因为两种缓冲液的pH值和离⼦强度都是相当的（
见表II），所以溶出曲线相似。虽然0.05M磷酸盐缓冲液（IntPh3）的缓冲容量略⾼于SIFsp，但并没有观察到溶出曲线的差异，这与Dressman等⼈以前的研究⼀致，他也发现SIFsp可以与0.05 M磷酸盐互换使⽤（37）。总的来说，醋酸盐缓冲液和空⽩FeSSIF⽐空⽩FaSSIF、 SIFsp和0.05M磷酸缓冲液（IntPh3）有更快的溶出速率。
通常，弱碱物在胃中有更快的溶出速率，它们在转运到⼩肠时会因为过饱和⽽发⽣沉淀。对卡维地洛⽽⾔，在⼗⼆指肠和餐后的肠道流体中会沉淀，这在卡维地洛在醋酸盐缓冲液（pH 4.5）和空⽩FeSSIF的溶出结果中可见⼀斑。然⽽，SIFsp和0.05M磷酸盐缓冲液（IntPh3）仍被普遍作为药典溶出介质（7,11,38-42）。
为了更好理解卡维地洛在肠液中以及进⼊⼩肠后的沉淀⾏为，需要测定卡维地洛⽚在不同离⼦强度及缓冲容量的磷酸盐缓冲液中的溶出度。图4a⽐较了Dilatrend⽚中卡维地洛在不同缓冲液浓度（6.25、12.5、25、50和100mM）的pH 6.8磷酸盐缓冲液中的溶出曲线。磷酸盐缓冲液离⼦强度和缓冲容量的变化见表III。以卡维地洛在零离⼦强度和零缓能⼒的双蒸⽔中的溶出曲线作为参照，磷酸盐缓冲液的离⼦强度范围从0.013到0.200mol/L，涵盖了⼈体肠液的离⼦强度范围（0.070-0.166mol/L）（17）。磷酸盐缓冲液的缓冲容量范围为0.003⾄0.047M/ΔpH，近似于⼈体肠液的缓冲容量（0.003-0.030M/ΔpH）（15,18）。
卡维地洛在双蒸⽔中的溶出速率⾮常慢，240min仅溶出了36.2%。由于磷酸盐缓冲液的⾼pH值（pH6.8），卡维地洛未能完全溶出。卡维地洛在6.25、12.5、25、50和100mM缓冲液中的溶出量分别只有69.6、84.7、80.3、75.5和74.1％。卡维地洛在6.25mM磷酸缓盐冲液中溶出量最低，240min仅为69.6％。在6.25mM磷酸缓盐冲液中的溶出曲线与12.5、25、50和100mM缓冲液有显著差异（f2＜50），这是因为6.25mM磷酸盐缓冲液的缓冲容量低（0.003M/ΔpH）。已有研究表明，降低溶出介质的缓冲容量可以降低药物的溶解度和溶出速率（43,44）。
当磷酸盐缓冲液中离⼦强度增加时，如12.5、25、50和100mM，在240min药物的溶出量分别为
薛万东12.5mM（84.7％），25mM（80.3％），50mM（75.5％）和100mM（74.1％），溶出曲线没有显著性差异（f2＞50）。这些结果与Kincl等⼈关于双氯芬酸在各种离⼦强度的磷酸盐缓冲液中从亲脂性⾻架⽚中的释放结果⼀致（36）。Kincl等⼈发现，双氯芬酸的释放随离⼦强度的增加⽽降低。然⽽，当磷酸盐缓冲液具有较⾼的离⼦强度时（0.14-0.51mol/L），溶出曲线并⽆明显差异。溶出度数据与溶解度结果⼀致。卡维地洛在磷酸盐缓冲液离⼦强度为25、50和100mM时，溶出曲线没有明显差异（f2>50）。
尽管卡维地洛在离⼦强度为6.25和12.5mM磷酸缓冲液中的溶解度相当，但卡维地洛在12.5mM磷酸盐中的溶出速率明显⾼于离⼦强度6.25mM的磷酸盐缓冲液。这可能是由于12.5mM磷酸盐缓冲液的缓冲
容量⽐6.25mM强。卡维地洛在12.5、25、50和100mM的磷酸盐缓冲液、SIFSP 和0.05M磷酸盐缓冲液（Int Ph3）中的溶出曲线没有显著差异
（f2>50）。
为了确认磷酸盐缓冲液的缓冲容量在整个溶出度实验过程中保持⼀致（特别是低浓度6.25、12.5和25mM），对缓冲液的pH值进⾏了测定，见图4b。结果表明，pH值⼀直保持与初始pH值6.80接近，最⼤偏差为初始pH值的±0.05pH/min。因此，pH测量结果证实磷酸盐缓冲液12.5、25、50和100mM保持了其缓冲容量。在离⼦强度6.25mM的磷酸盐缓冲液中，pH值偏离初始pH值最⼤值达6.93，这表明初始pH值不能在整个溶出试验中持续保持。
为了进⼀步研究pH值对卡维地洛释放度速率的影响，进⾏了pH 7.2和7.8的100mM磷酸盐缓冲液中的溶出度研究。卡维地洛在这些介质中的溶出⾏为与pH 6.8的100mM磷酸盐缓冲液中的溶出⾏为进⾏了⽐较（见图5）。在pH 6.8中，卡维地洛在240min的最⼤溶出量约为74.1％；在pH 7.2中，溶出速率较慢，240min时仅溶出43.6％；在pH7.8时最
慢，240min只有15.9％。这些结果表明，卡维地洛在远端⼩肠和结肠中有⽐较差的溶解度，使其不适合作为控释制剂（11）。卡维地洛在这些介质中的溶出结果与其溶解度数据⼀致（见表VI）。
结论
本⽂着重研究了弱碱性pH依赖性BCS II类药物卡维地洛（pKa值为7.8）的溶解度和溶出⾏为。
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