食品微生物检测方法
范围
本标准规定了食品微生物检测方法
1.1 培养基和试剂
⑴、营养琼脂培养基：按GB/T4789.28-2003中4.7规定
成分: 蛋白胨 10克、牛肉膏3克、氯化钠5克、琼脂15～20克 、蒸馏水 1000ml
制法： 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液2ml校正PH至7.2-7.4.加入琼脂,加热煮沸,使用权琼脂溶化.分装烧讧,121℃高压灭菌15分钟. 注:此培养基可供一般细菌培养之用,注平板或制成斜面.如用于菌落计数,琼脂量为1.5%;如作成平板或斜面,则应为2%.
⑵ 磷酸盐缓冲液:按GB/T4789.28-2003中3.22规定.
成分： 磷酸二氢钾 34克、1mol/l氢氧化钠溶液175ml、蒸馏水825ml 、PH7.2
制法: 先将磷酸盐溶解于500ml蒸馏水中,用1mol/l氢氧化钠溶液校正PH后,再用蒸馏水稀释至1000 ml. 稀释液: 取储存液1.25 ml ,用蒸馏水稀释至1000 ml,或每管10ml,121℃高压灭菌15分钟.
⑶ 明胶磷酸盐缓冲液
成分:明胶 2克、磷酸氢二钠 4克、蒸馏水 1000ml、PH6.2
制法:加热溶解,校正PH,121℃高压灭菌15分钟.
⑷ 0.85%灭菌生理盐水
⑸ 75%乙醇
1.2 设备和材料
⑴ 冰箱：0~4℃
⑵ 恒温培养箱36℃±1℃
⑶ 恒温水浴锅46±1℃
⑷ 均质器或灭菌乳钵
⑸ 架盘药物天平：0~500克，精确至0.5克.
⑹ 菌落计数器.
⑺ 大镜4×
⑻ 灭菌吸管:1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)
⑼ 灭菌锥形瓶:500ml
⑽ 灭菌玻璃珠:直径约5mm
⑾ 灭菌培养皿直径约90mm
⑿ 灭菌试管16mm×160mm
⒀ 灭菌刀、剪子、镊子等。
1.3 检验程序（ 菌落总数的检验程序见图1）
1.4 操作步骤
⑴ 检样稀释及培养
a. 以无菌操作将检样25克(ml)剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8000r/min～10000r/min的速度处理1min,做成1：10的均匀稀释液。
b. 用1ml的灭菌吸管吸取1：10的稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。
c. 另取1ml灭菌吸管，按上条操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml吸管。
d. 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，，选择2～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。
e. 吸稀释液移入培养皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基（可放置46±1℃水浴锅保温）注入培养皿约15ml 并转动培养皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液灭菌培养皿内作空白对照。
f. 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48h±2h.
⑵ 菌落计数方法
做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。
⑶ 菌落计数的报告
a. 平板菌落数的选择
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平板内如有链状菌落生长时（菌落间无明显界线），若仅有一条链。可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。
b. 稀释度的选择
1. 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乖以稀释倍数报告之（见表1中例1）。
2. 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2，则报告其中较小的数字，（见表1中例2及例3）。
3. 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以箕释倍数报告之（见表1中例4）。
4. 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例5）。
5. 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（见表1中例6）。
6. 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例7）。
c. 菌落数的报告
菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后在的零数，也可用10的指数来表示（见表1）。
表1稀释度选择及菌落数报告方式
例次 | 稀释液及菌落数 | 两稀释液之比 | 菌落总数 （cfu/g） | 报告方式（cfu/g(ml)） |
10-1 | 10-2 | 10-3 |
1 | 多不可计 | 164 | 20 | － | 16400 | 16000 |
2 | 多不可计 | 295 | 46 | １.6 | 37750 | 38000 |
3 | 多不可计 | 271 | 东京国际动漫节60 | 2.2 | 27100 | 27000 |
4 | 多不可计 | 多不可计 | 313 | － | 313000 | 310000 |
5 | 27 | 11 | 5 | － | 270神经网络预测 | 270 |
漂亮者生存6 | 托尔斯泰主义0 | 0 | 0 | － | <1×10 | <10 |
7 | 多不可计 | 305 | 12 | － | 30500 | 31000 |
| | | | | | |
2 大肠菌的检测
2.1 大肠菌的测定
2.1.1 设备和材料
⑴ 恒温培养箱：36±1℃。
⑵ 冰箱：0～4℃。
⑶ 恒温水浴锅：44.5±0.5℃。
⑷ 架盘药物天平:0～500g,精确至三中全会决定0.5g。
⑸ 显微镜10×～100×。
⑹ 均质器或乳钵。
⑺乘车 平皿：直径为90mm。
⑻ 试管16mm× 160mm。
⑼ 吸管1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)。
⑽ 广口瓶或三角烧瓶：容量为500mL。
⑾ 玻璃珠：直径约5mm。
⑿ 载玻片。
⒀ 酒精灯。
⒁ 试管架。
⒂ 灭菌刀、剪子、镊子
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