晨凡;秦鲜菊;徐思源;宁喜斌
【摘 要】为研制一种可同时富集沙门氏菌和副溶血性孤菌的增菌培养基,参照GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013规定的增菌培养基成分,并根据目标菌不同的营养需求,筛选适宜抑制剂和促进剂,进行单因素实验,确定共增菌培养基的配方,并验证该培养基的增菌效果.结果表明:研制出用于沙门氏菌和副溶血性弧菌的共增菌培养基成分为:蛋白胨10.0 g,磷酸二氢钾1.5 g,氯化钠7.5 g,硫代硫酸钠5.0 g,牛胆盐0.1g,柠檬酸钠2.5 g,甘露醇2.5 g,葡萄糖2.5 g,蒸馏水1000 mL.目标菌初始接种量为102 CFU/mL,在37℃下培养16 h后,两种目标菌的菌浓度可达到107～108 CFU/mL.结果表明,共增菌培养基可用于沙门氏菌和副溶血性弧菌的富集培养,培养基配制简易,节约成本,具有良好的市场前景. 【期刊名称】《食品工业科技》
【年(卷),期】2018(039)019
【总页数】6页(P119-124)
【关键词】沙门氏菌;副溶血性孤菌;共增菌;培养基
【作 者】晨凡;秦鲜菊;徐思源;宁喜斌
统计与决策
磷酸氢镁【作者单位】上海海洋大学食品学院,上海201306;上海海洋大学食品学院,上海201306;上海海洋大学食品学院,上海201306;上海海洋大学食品学院,上海201306;上海海洋大学,食品科学与工程国家级实验教学示范中心,上海201306;上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海201306;国家淡水水产品加工技术研发中心(上海),上海201306【正文语种】中 文
【中图分类】TS201.3
1905年俄国革命食源性致病菌是引起食源性疾病的主要因素之一,在世界食品安全领域中备受关注。世界卫生组织(WHO)最新研究报告表明,在2015年全球有5600多万人死亡,其中约有139万人死于腹泻病[1]。在众多食源性致病菌中,沙门氏菌与副溶血性弧菌最受关注。2008～2015年间,我国共有1597起食物中毒事件,其中由食源性致病菌引起的食物中毒占总中毒人数的62.02%,而在所有致病菌中,沙门氏菌和副溶血性弧菌分别在常见微生物食物中毒占比23%
和21%,分别为第一和第二位[2-3]。
非洲猪瘟最新动态近年来,在食源性致病菌快速检测方面,检测方法主要涉及免疫学、代谢学、以DNA探针等技术为代表的分子生物学等,较之传统国标法检测,具有较高的特异性和灵敏性。现代技术如多重PCR、基因芯片等,甚至可以实现同一平台上对多种致病菌的检测[4-7]。同时,检测方法的快速发展也要求样品前处理步骤更加快捷,在食源性致病菌的检测过程中,仍需要对目标菌进行富集培养，但是不同的致病菌有特定的前增菌步骤,沙门氏菌等菌株更是需要进行多步增菌过程,较为费时、费力[8]。因此,研制可同时富集多种致病菌的共增菌培养基成为研究的热点,这对于提高致病菌共检技术的效率具有重要意义。沙门氏菌和副溶血性弧菌均为食品中重要的致病菌,研究其共增菌技术对于控制其疾病的传播及预防相应的食物中毒具有重大意义。
目前国内外研究中,涉及多种致病菌共增菌培养基的研究已有:沙门氏菌、志贺氏菌和金黄葡萄球菌的共增技术[9],沙门氏菌、大肠杆菌和金黄葡萄球菌的共增技术[10],沙门氏菌、大肠杆菌和单增李斯特氏菌的共增技术[11],沙门氏菌、金黄葡萄球菌和单增李斯特氏菌的共增技术[12]等,其中大部分培养基选择性增菌能力不强,不能满足对目标菌进行富集的要
求。翁思聪等[13]研究了一种选择性富集沙门氏菌、志贺氏菌、金黄葡萄球菌和副溶血性弧菌共增菌培养基,由于其共增菌的菌株种类较多,菌株间存在较为复杂的抑制和共生关系,容易影响检出效率和重复率。沙门氏菌和副溶血弧菌均为革兰氏阴性菌,需氧或兼性厌氧,营养需求不高,且两种细菌均可利用葡萄糖、柠檬酸和甘露醇作为碳源,因此可在同种培养条件下迅速生长,两者在同一选择性增菌环境中共增菌具有现实的可行性,且更具有针对性。
本实验对富集沙门氏菌和副溶血性弧菌两种引起食源性疾病致病菌的共增菌培养基进行了研究,对其增菌效果进行了初步的评估验证,并根据目标菌不同的营养需求,筛选适宜抑制剂和促进剂,进行单因素实验,确定共增菌培养基的配方,最后验证该培养基的增菌效果,以得到具有较优增菌效果的共增菌培养基,为今后检测方法的修订提供必要的依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
沙门氏菌(Salmonella enteritidis，Se)CMCC 15611、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolytic
us，Vp)ATCC 13847 均为本研究室保藏;营养肉汤、营养琼脂培养基 分析纯,用于食品及其他物品检验中的菌落计数(上海疾控)上海华康科技开发公司；木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(Xylose lysine deoxycholate agar,XLD) 分析纯,用于沙门氏菌的选择性分离，北京陆桥技术有限责任公司;硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar,TCBS) 分析纯,用于致病性弧菌的选择性分离，青岛高科园海博生物技术有限公司;蛋白胨 分析纯，生工生物工程(上海)股份有限公司;磷酸氢二钾、柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)、硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)、氯化钠、葡萄糖、甘露醇 分析纯，国药集团化学试剂有限公司;牛胆盐 分析纯，广东环凯微生物科技有限公司。r440方向盘
THZ-300恒温培养摇床、THZ-300隔水式培养箱9270 上海一恒科技有限公司;InoLab pH730台式pH测量仪 德国WTW公司;UV-1100型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。
1.2 实验方法
光州事件1.2.1 基础培养基的选择 参照沙门氏菌、副溶血性弧菌在食品安全国家标准GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013中规定的增菌培养基配制方法,分别列出其中的成分及含量,参考刘
园园等[12]方法,去除培养基中具有选择性的组分,并根据两种细菌生长所必要的成分确定共增菌培养基的基础成分。
1.2.2 共增菌培养基中单因素成分的筛选 根据两种细菌营养需求和抑制条件的不同,参考之前的研究[11-12]和两种目标菌各自选择培养基中的特异成分,筛选不同的抑制剂和促进剂进行实验。将添加成分列为:葡萄糖、柠檬酸钠、硫代硫酸钠、甘露醇、氯化钠、牛胆盐。根据方法1.2.1配制基础培养基,取四支试管编号1～4号,其中1号试管作为空白对照,只加入基础培养基4 mL,2、3、4号试管分别加入含低浓度、中浓度、高浓度添加成分的基础培养基4 mL(见表2),分装后高压灭菌备用。将沙门氏菌和副溶血性弧菌分别接入不同添加成分的培养基中,在37 ℃,120 r/min下摇床振荡培养24 h,用紫外可见分光光度计测定在600 nm波长处的光密度OD值,以此确定适宜添加成分及适宜添加量,制备共增菌培养基。
1.2.3 目标菌增菌效果的验证 以102 CFU/mL作为目标菌初始接种量,将沙门氏菌及副溶血性弧菌分别接种至共增菌培养基中,于37 ℃摇床中振荡培养24 h。分别取0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h时的菌液1 mL,加入9 mL生理盐水中,制成1∶10稀释液,以此类推,分别进行适宜梯度稀释,每个梯度平行三次,平板涂布至XLD及TCBS培养基中,
置于37 ℃培养箱中培养24 h,对平板进行菌落计数,并乘以对应的稀释倍数,得出总菌落数,绘制目标菌生长曲线并分析结果。由于营养肉汤没有特定选择性,且沙门氏菌和副溶血性弧菌均可在营养肉汤中生长,故以营养肉汤增菌液作为对照组,重复上述操作,得出对照组生长曲线。并以102 CFU/mL为初始接种量,将沙门氏菌及副溶血性弧菌以1∶1比例一同接种至共增菌培养基中,于37 ℃摇床中振荡培养24 h并稀释涂布平板,观察目标菌生长情况并计算菌落总数,实验平行三次,同样以营养肉汤作为对照组,验证培养基共增菌效果。
1.3 数据处理
利用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行数据统计,对培养基不同成分添加后目标菌的生长情况进行单因素显著性差异分析,对目标菌在共增菌培养基及对照组中的增菌情况进行配对T检验,进行显著性差异分析。
2 结果与分析
2.1 基础培养基的筛选
根据GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013,对目标菌增菌培养基成分进行比较,结果如表1所
示。由表1分析可知,蛋白胨为沙门氏菌和副溶血性弧菌提供氮源和能源,参照国标，其含量取10.0 g为宜,氯化钠在增菌液中起到调节渗透压的作用,而磷酸二氢钾的添加可以稳定菌体生长过程中pH的变化[10],综合考虑两种目标菌的基本生长条件及配制简便性,取氯化钠5.0 g,磷酸氢二钾1.5 g为适宜含量,得出共增菌培养基的基础成分为:蛋白胨10.0 g,磷酸二氢钾1.5 g,氯化钠5.0 g,蒸馏水1000 mL。将以上成分进行分装,振荡摇匀,调节pH至7.2～7.4,于1×105 Pa高温灭菌15 min后置于4 ℃保存备用。
表1 目标菌增菌培养基成分比较Table 1 Comparison of enrichment medium compositions of target bacteria目标菌增菌培养基成分含量(g·L-1)沙门氏菌缓冲蛋白胨水(BPW)蛋白胨10.0氯化钠5.0磷酸氢二钠(含12个结晶水)9.0磷酸二氢钾1.5副溶血性弧菌3%氯化钠碱性蛋白胨水蛋白胨10.0氯化钠30.0
2.2 共增菌培养基添加成分及含量
添加抑制剂和促进剂的增菌液按浓度从低到高进行排列,成分及添加浓度如表2所示。
表2 各添加成分及其添加量Table 2 Additive amount of different candidate agents成分低浓
度(g·L-1)中浓度(g·L-1)高浓度(g·L-1)硫代硫酸钠2.55.010.0氯化钠2.55.010.0牛胆盐0.10.20.3柠檬酸钠1.252.55.0甘露醇1.252.55.0葡萄糖1.252.55.0
将目标菌接种培养后,在基础培养基中培养24 h后,沙门氏菌的OD600值为0.523±0.014,副溶血性弧菌的OD600值为0.332±0.007,以此作为空白对照。在添加不同成分的基础培养基中培养24 h后,两种目标菌的OD600值如表3所示。
表3 各添加成分对两种目标菌生长的影响Table 3 Effect of different candidate agents on the growth of two target bacterias添加成分浓度(g·L-1)目标菌OD600值SeVp对照组-0.523±0.0140.332±0.007硫代硫酸钠2.50.654±0.016b*0.265±0.004b*5.00.786±0.004a*0.306±0.005a*10.00.421±0.009c*0.221±0.010c*氯化钠2.50.703±0.013a*0.721±0.009b*5.00.450±0.008b*0.703±0.010b*10.00.205±0.007c*0.987±0.022a*牛胆盐0.10.614±0.013a*0.293±0.021a*0.20.463±0.007b*0.240±0.008b*0.30.117±0.007c*0.170±0.016c*柠檬酸钠1.250.776±0.009b*0.404±0.012a*2.50.833±0.028a*0.423±0.009a*5.00.504±0.0
06c0.239±0.010b*甘露醇1.250.553±0.037c0.316±0.013b2.50.667±0.029b*0.379±0.007a*5.00.710±0.010a*0.358±0.006a*葡萄糖1.250.517±0.004b0.304±0.005b*2.50.578±0.006a*0.371±0.004a*5.00.598±0.018a*0.385±0.021a*
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