(1) 固定:用50%或70% FAA固定液(50%或70%酒精:甲醛:冰乙酸=16:1:1; 幼嫩材料用50 % FAA;老的材料用70%的FAA),置于4℃固定24 h。 (2)脱水:将固定液倒去,加入50%乙醇,室温静置30 min ;重复一次,室温静置20 min。换成1%番红溶液(用70%酒精配制),室温脱水染过夜。次日继续脱水,酒精浓度梯度和时间依次为:80% 乙醇1h、95% 乙醇 1h、无水乙醇1h、40min(2次)。
(3)透明:1/2无水乙醇+二甲苯混合液1h,纯二甲苯1h、40 min(2次)。最后加入少量二甲苯(浸没材料即可)和碎蜡,放入382012奥运会羽毛球男双决赛℃温箱中过夜。
(4)浸蜡:将温箱温度调至56℃,计时1h不要闭上眼睛;换成二级蜡1h;三级蜡(3次)各1h、1h、40min(从温度上升到56℃开始计时)。
(5)包埋:将带有材料的液体蜡倒入叠好的纸槽中,迅速放入冰水中使蜡凝固,防止气泡产生,以及凝蜡不匀。
(6)切片:修整蜡块,用Lica RM2126切片机切片,厚度5-10 μm。
伦敦铜
(7)贴片: 在载玻片上涂少许粘片剂,将切好的蜡带放入温水中,捞至载玻片上,最后置于37℃恒温箱过夜烤片。
(8)脱蜡及染:
① 番红-固绿对染
ⅰ 脱蜡:二甲苯60min,二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、1%番红室温过夜。
ⅱ 染: 80%乙醇5 min,1%固绿(用95%酒精配制)迅速蘸一下,大约10s,直接放到95%乙醇5min 、无水乙醇5min、无水乙醇5min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5min、二甲苯5 min(2次)。
② 甲苯胺蓝染
ⅰ 脱蜡:二甲苯60 min、二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min、50%乙醇5 min 、30%盛女爱作战乙醇5 min、蒸馏水5 min。
ⅱ遗传学三大定律 染: 用0.2-1%甲苯胺蓝染1-10 min,自来水冲洗30s、 95%乙醇分大约20s、无水乙醇脱水2次,各5min、二甲苯透明2次,各5min。
③ I2-KI染淀粉颗粒
ⅰ 脱蜡:同甲苯胺蓝染脱蜡
ⅱ 染: I2-KI 10 min,快速用三氯乙烷冲洗,自来水冲洗30s、无水乙醇脱水2次,各5min、二甲苯透明2次,各5min。
(9) 封片:从二甲苯中取出后,立即在载玻片上滴一滴中性树胶,盖上盖玻片,放至37℃恒温箱中烤片。
(10) 镜检: 将组织切片置于Motic B5 professional series光学显微镜下( Bock Optronics Inc., Canada)观察, 并用Motic Images Advanced 3.1 软件显微拍照。