・2380・名曲扌如1丸Drug Evaluation Research第43卷第12期2020年12月
李伟，李政楠，王秀娟，牟春琳，杨莹，金星，徐永胜•
天津长和生物技术有限公司，天津301925
摘要：目的观察人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对SD大鼠膝骨关节炎的效果。方法8周龄近交系SD雄性大鼠6只，均釆用自身双侧对照研究。应用手术方法切断双膝关节前交叉韧带，手术后不固定伤肢，笼内自由活动。术后4周，右侧作为模型侧，左侧膝关节注射hUC-MSCs100g L(1X107cells/mL)o注射后4周，处死所有实验组大鼠并收取双侧膝关节标本，进行HE和甲苯胺蓝染。结果模型侧细胞排列紊乱，细胞簇集明显，有细胞消失、基质染不均、软骨结构改变、表面凹凸不平、软骨层次较差等现象，表明软骨蜕变，骨关节炎形成；hUC-MSCs侧与模型侧相比，软骨细胞排列基本整齐，呈柱状，细胞增生较多，细胞簇集明显减少，潮线较完整。软骨表面相对平滑，表明软骨处于损伤修复中。结论hUC-MSCs移植有助于改善大鼠膝骨关节炎，使大鼠关节软骨破坏减轻，促进软骨组织修复。 关键词：脐带间充质干细胞；骨关节炎；HE染；甲苯胺蓝染
中图分类号：R329文献标志码：A文章编号：1674-6376(2020)12-2380-05
DOI:10.7501/j.issn.l674-6376.2020.12.004
Experimental study of human umbilical cord mesenchymal stem cells in treatment of knee osteoarthritis in rats
LI Wei,LI Zhengnan,WANG Xiujuan,MOU Chunlin,YANG Ying,JIN Xing,XU Yongsheng
Ever Union Biotechnology Company Limited,Tianjin301925,China
Abstract:Objective To observe the therapeutic effect of human umbilical cord mesenchymal stem cell injection on knee osteoarthritis in SD rats.Methods Inbred Sprague Dawley(SD)male rats of eight weeks old were studied by bilateral self control. The anterior cruciate ligament of both knee joints was cut by surgical method,the injured limb was not fixed after surgery,and the cage was free to move.Four weeks after the operation,human umbilical cord mesenchymal stem cell injection of100piL(1x107 cells/mL)was injected into the left knee joint.Four weeks after injection,all rats in the experimental group were sacrificed and bilateral knee specimens were collected.Results HE and toluidine blue staining showed that the cells on the single operation side were disordered,the cell clusters were obvious,the cells disappeared,the matrix staining was uneven,the cartilage structure changed,the surface was uneven,and the cartilage level was poor,indicating that the cartilage was in
metamorphosis and osteoarthritis was formed.Compared with the single operation side,the stem cell treatment side showed that chondrocytes were arranged in a basically neat columnar shape,with more cell proliferation,significantly reduced cell clusters,and relatively intact tidal line.The cartilage surface is relatively smooth,indicating that the cartilage isin repair from injury.Conclusion hUC-MSCs transplantation therapy can improve the arthritis of rats,reduce the damage of articular cartilage and repair the cartilage tissue.
Key words:human umbilical cord mesenchymal stem cell;knee osteoarthritis;HE staining;toluidine blue staining
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种严重危害人类健康的慢性骨关节疾病，其在关节病中数量最多，超过类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis>RA)强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)等其他关节炎的总和。在病理水平，OA表现为关节软骨的破坏及骨赘的异常增生，以致临床上出现关节疼
痛、活动受限及关节畸形等。同时，OA是导致青壮年劳动力下降的最主要病因，造成重大经济负担。
流行病学研究显示，在世界范围内，65岁以上的人口中，有超过一半为OA患者小。在我国，随着人口
收稿日期：2020-09-11
基金项目：国家重点研发计划"干细胞及转化研究."重点专项(2019YFA0112100)；天津市科技计划项目(17ZXXYSY00020) *通信作者：徐永胜，临床医学博士。E-mail:***********************
黑拎.钳吋总Drug Evaluation Research第43卷第12期2020年12月・2381-
老龄化的进程,OA的发病也呈现逐年上升的趋势。
我国曾开展了大规模关于膝关节OA的流行病学研究，结果显示在中国症状性膝关节OA的患病率为8.1%⑵，这一数据高于西方，而且在中国农村地区的患病率高于城市地区®。同时，在中国农村地区，症状性膝关节OA会增加人的全因死亡率⑷。因此，非常有必要以膝关节OA为切入点，采取有效的手段控制OA的发展，缓解症状，提高患者的生存质量。
近年来，在基础研究方面，组织工程技术的发展为脐带间充质干细胞（UC-MSCs）提供了大量的机会。作为前体细胞的UC-MSCs可以定向分化为各种体细胞，包括成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞等®%因此，有研究利用UC-MSCs的这种定向分化功能软骨再生⑼。同时,UC-MSCs还具有抑制T淋巴细胞的功能，从而降低了OA中的炎症反应何。还有研究显示,UC-MSCs具有旁分泌功能，其可以分泌表皮生长因子（EGF）、转化生长因子卩（TGF-卩）、血管内皮生长因子（EVGF）等生长因子，从而促进软骨的再生何。另外-UC-MSCs还会释放一些细胞因子缓解疼痛，从而减轻患者的症状"•叭最新的研究表明-UC-MSCs释放的外泌体携带有多种microRNA、mRNA、脂质体、蛋白等，这些生
物因子可能在促进软骨细胞的再生中发挥了重要作用E〕。由此可见,UC-MSCs通过多种机制在软骨修复和缓解疼痛方面发挥了作用。
本研究通过人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）干预SD大鼠OA的模型，观察效果。
1材料
1.1实验动物
SPF级SD雄性大鼠，8周龄，6只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2017-0011。
1.2主要试剂
阿佛丁注射液（中国科学院生物物理研究所，批号T48402）；10X磷酸盐缓冲液［中科迈晨（北京）科技有限公司］;AvertinC Sigma-Aldrich）；叔戊醇、乙二胺四乙酸、无水乙醇、二甲苯（国药集团）；氯化钠注射液（石家庄四药有限公司）；伊红染液、苏木素染液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；甲苯胺蓝染液（北京欣华绿源科技有限公司）。
1.3主要仪器
石蜡包埋机（型号EG1150H）、全封闭组织脱水机（型号ASP200S），轮转式切片机（型号RM2255）、多功能染机（型号ST5020）、全自动封片机（型号CV5O3O），探卡显微系统（上海）贸易有限公司；生物显微镜［尼康仪器（上海）有限公司，型号Ci］。
2方法
2.1hUC-MSCs的制备
利用脐带组织原代培养法提取hUC-MSCso无菌条件下，取脐带1根（脐带来源于健康状态良好、足月剖宫产产妇自愿捐献），剪成2cm长小段，去除脐带表皮、动脉及静脉，用PBS反复清洗3次，去除红细胞。将清洗完毕的脐带组织剪碎至乳糜状，用无菌巴士管以2mm3点板，10cm组织培养皿置于37°C,5%CO2培养箱中培养。1h后补充完全培养基，72h后换液，观察细胞生长情况。随后每3天换液,10d左右传代至Pl代，随后按照1：5进行扩增培养，每4天传代1次，至P5代细胞冻存。冻存前进行细胞计数，无菌、内毒素、流式分析，结果符合要求。按试验所需细胞数量复苏,hUC-MSCs浓度为IX 107cells/mL，批号M2017122501，保存条件2—8°C，有效期12h。
2.2OA模型建立与⑴旳
经过适应性培养的SD大鼠，均采用自身双侧对照研究。ip阿佛丁注射液进行麻醉，剂量为2.5g/mg，
麻醉前禁食禁水12h。麻醉后，于双侧膝关节沿韻韧带内侧缘切口，打开关节腔后；切断前交叉韧带，保留后交叉韧带，术闭缝合伤口"，不固定
伤肢，自由活动，术后抗感染止痛。4周后，ip阿佛丁注射液进行麻醉，右侧作为模型侧，左侧膝关节腔内注射hUC-MSCs100gL（lX107cells/mL），注射后大鼠可在笼内自由活动。
2.3大鼠膝关节取材
注射hUC-MSCs4周后，通过CO：窒息的方式处死SD大鼠并收集双侧膝关节标本。随机选取一组进行大体标本观察，其余浸泡在4%多聚甲醛溶液中用于制备石蜡切片，进行HE、甲苯胺蓝法检测。
2.4HE、甲苯胺蓝染
m901将浸泡在4%多聚甲醛溶液中的组织取出，置于10%EDTA磷酸盐缓冲液（PBS）中，进行脱钙处理，每隔3〜4d更换1次脱钙液。
2.4.1蜡块制备及切片将浸泡在10%EDTA脱钙液中的组织取出，置于70%乙醇溶液，再经过脱水机自控完成80%、90%、95%、100%乙醇浸泡2h，完成脱水过程。经过透明过程后，将组织放入熔化的石蜡中浸渍。待石蜡凝固后，即得到带组织的蜡
・2382•黑总Drug Evaluation Research第43卷第12期2020年12月
块。蜡块固定在切片机上后，将组织切成5pm 的切片，用毛笔轻轻托起放在纸上。用眼科银银起
蜡带轻轻平铺在40〜45°C的水面上，借水的张力和水的温度，将蜡带自然展平。待切片在恒温水面上充分展平后，将蜡片放置载玻片上，倾去载玻片上的余水，磨砂面标记编号。
2.4.2HE染将切片置入染机配套的玻片篮，放入65〜70°C恒温烤箱，烤片15min，置入染机中，详细操作见表1。待程序结束后，从二甲苯中取出切片，置入自动封片机，中性树胶封片、固定。
表1HE染操作步骤
Table1Operation steps of HE dyeing 操作顺序试剂作用时间1二甲苯6min
2二甲苯6min
3二甲苯6min
4无水乙醇40s
5无水乙醇40s
695%乙醇40s
795%乙醇40s
880%乙醇40s
9自来水1min
10苏木素10min
11自来水30s
121%盐酸乙醇12s
13自来水12s
14促蓝液30s
15自来水8min海关总署公告2012年第15号
160.5%水溶性伊红2min
17自来水12s
1880%乙醇12s
1995%乙醇12s
2095%乙醇12s
21无水乙醇12s
22无水乙醇12s
23苯酚二甲苯3min
24二甲苯30s
25二甲苯30s
2.4.3甲苯胺蓝染将切片置入染机配套的玻片篮，放入65-70。（3恒温烤箱，烤片15min，置入染机中，详细操作见表2。待程序结束后，从二甲苯中取出切片，置入自动封片机，中性树胶封片、固定。
2.4.4切片观察用尼康显微镜Ci显微镜观察HE、甲苯胺蓝等方法染后的切片，用N1S-Elements F软件，在相同的曝光时间下记录切片的染情况，并拍摄的照片，判断损伤情况。
表2甲苯胺蓝染操作步骤
Table2Operation steps of toluidine blue staining
操作顺序试剂作用时间1：甲苯6min
2二甲苯6min
3二甲苯6min
4无水乙醇40s
5无水乙醇40s
695%乙醇40s
795%乙醇40s爱的旅程全文阅读
880%乙醇40s
9自来水1min
10甲苯胺蓝10min
11自来水2min
1280%乙醇12s
1395%乙醇12s
1495%乙醇12s
15无水乙醇12s
16无水乙醇12s
17苯酚二甲苯3min
18二甲苯30s
19二甲苯30s
3结果
3.1膝关节大体标本观察
SD大鼠膝关节大体标本显示，其关节软骨均有不同程度损伤，建模成功。
3.2组织学观察
HE和甲苯胺蓝染结果表明，模型侧软骨细胞排列紊乱，细胞簇集明显，有细胞消失、基质染不均、软骨结构改变、表面凹凸不平、软骨层次较差等现象，表明软骨处于蜕变，骨关节炎形成；与模型侧相比，hUC-MSCs侧软骨细胞排列基本整齐，呈柱状，细胞增生较多，细胞簇集明显减少，潮线较完整。软骨表面相对平滑，表明软骨处于损伤修复中。hUC-MSCs侧从组织学观察均优于模型侧。结果见图1、2。
4讨论
最早用于OA的细胞技术是自体软骨细胞移植，其优势在于使用自己细胞降低了免疫原性，成功率高，并获得FDA批准等，其劣势在于两次手术增加患者的痛苦，取材及软骨细胞扩增数量有限，细胞增殖能力随年龄增长而下降等皿。胚胎干细胞的优势在于具有很强的自我更新和多能分化功能，具有无限增殖能力等，而劣势在于较高的致瘤风险、伦理问题以及免疫异质性诱导多能干细胞是从体
三聚氰胺甲醛树脂细胞向干细胞逆分化从而获得干细胞的功能，其优势在于较低的免疫源性，具有较强的
名乂；钳环总Drug Evaluation Research第43卷第12期2020年12月•2383・
甲苯胺蓝染
HE染
图1膝关节组织切片染结果(xlO)
Fig.1staining results of knee joint tissue section(xlO)
HE染甲苯胺蓝染
hUC-MSCs
图2膝关节组织切片染全景扫描结果(xlO)
Fig.2Panoramic scanning results of section staining of knee joint tissue(xlO)
自我分化和增殖能力等，劣势在于逆分化的难度、
残存部分体细胞表型以及高致瘤风险等hUC-MSCsOA的优势在于组织来源广泛，扩增分化容易，分化的细胞具有组织特异性、抗炎和招募作用、低成瘤风险、免疫源性低等特点，但目前的临床随机对照试验数量有限，尚需要进一步的临床研究证实其疗效⑴如。
本研究存在的主要不足是研究还处于动物实验阶段；对hUC-MSCs缓解疼痛的机制、软骨细胞再生和软骨祖细胞原位再生，以及受损关节软骨修复过程和机制不清。hUC-MSCs对OA有多大效果，是能够逆转OA的发病机制，使其恢复正常，还是能够阻止已有症状的关节炎进一步发展，仍需要大量基础研究以及临床实验后才能得出结论。
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