黄林剑;邓思敏;陈军;徐昕;严君烈;蔡协艺
【摘 要】目的 研究不同软骨染方法在髁突软骨、股骨软骨和生长板软骨中的染差异.方法 取健康雌性新西兰大白兔颞下颌关节髁突、膝关节股骨,分别进行苏木精-伊红(HE)染、甲苯胺蓝染、阿利新蓝染、番红O-阿利新蓝染、番红O染、番红O-快绿染,光学显微镜下观察分析各软骨组织结构.结果 HE染髁突纤维软骨各层结构清晰,关节软骨基质呈嗜碱性蓝染,骨组织呈嗜酸性红染;甲苯胺蓝染关节软骨基质呈蓝紫,骨组织不着;阿利新蓝染软骨基质呈淡蓝,骨组织不着;番红O-阿利新蓝染关节软骨呈浅蓝,骨组织呈淡红,但是髁突软骨纤维层和增殖层红染;番红O染中髁突软骨基质呈红,股骨软骨和生长板软骨呈橘黄,骨组织呈淡红;番红O-快绿染关节软骨基质呈红,骨组织呈绿,在髁突纤维软骨中纤维层呈明显绿染.结论 不同的染方法可以特异性展现软骨组织结构.在今后透明软骨和纤维软骨的研究中,因根据研究对象、研究目的等选用适合的染方法,以期最佳的反映研究部位的形态结构.%Objective To explore the characteristic of different cartilage staining methods for condylar fibrocartilage and femoral hya-line cartilage in rabbit. Method s Temporomandibular joints and knee joints were harvested from healthy female Newzealand White rabbits. HE staining,Toluidine blue staining,Alcian blue staining,Safranin O-Alcian blue staining,Safranin O staining,Safranin O-Fast green staining were used to observe and analyse the organizational structure of the cartilage under optical microscope.Results Or-ganizational structure of the articular cartilage was clear in HE staining,such as cartilage matrix was dyed blue and bone was dyed red. Articular cartilage matrix was dyed violet and bone was not stained in Toluidine blue staining. Articular cartilage matrix was dyed light blue and bone was not stained in Alcian blue staining.Articular cartilage matrix was dyed light blue and bone was dyed light red in Saf-ranin O-Alcian blue staining,but the fiber layer and proliferation layer of condylar cartilage were dyed red.In Safranin O staining,bone was dyed light red,whereas the cartilage matrix of the condyle was dyed red and the cartilage matrix of the femur was dyed orange. Ar-ticular cartilage matrix was dyed red and bone was dyed green in Safranin O-Fast green staining. Meanwhile,the fiber layer of the con-dylar cartilage was dyed green. Conclusions Different cartilage staining methods show structure of cartilage t
issue specificity. We rec-ommend that we should choose suitable cartilage staining methods according to our research purpose and specimen in the future study.
【期刊名称】《口腔医学》
【年(卷),期】2018(038)002
【总页数】5页(P104-108)
【关键词】关节软骨;髁突;股骨;生长板;软骨染
【作 者】黄林剑;邓思敏;陈军;徐昕;严君烈;蔡协艺建设项目环境保护分类管理名录
【作者单位】浙江大学医学院附属第二医院·口腔颌面外科,浙江杭州310009;上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔外科,上海市口腔医学重点实验室,上海200011;浙江大学医学院附属第二医院·口腔颌面外科,浙江杭州310009;浙江大学医学院附属第二医院·口腔颌面外科,浙江杭州310009;浙江大学医学院附属第二医院·口腔颌面外科,浙江杭州310009;浙江大学医学院附属第二医院·口腔颌面外科,浙江杭州310009;上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔外科,上海市口腔医学重点实验室,上海200011
【正文语种】中 文
【中图分类】R780.2
关节软骨(articular cartilage, AC)位于活动关节的表面，是一种高度特异的有一定弹性的负重组织[1]。关节软骨对维持关节正常生理功能至关重要，具有润滑、吸收缓冲关节内压力及将压力传递分流至软骨下骨的作用。关节软骨主要由固相和液相两个部分组成，固相主要包括软骨细胞、胶原纤维、蛋白多糖(proteoglycan, PG)；液相主要包括水和无机盐等[2-3]。软骨基质主要由胶原纤维、蛋白多糖和水组成。关节软骨大致可分为两类：纤维软骨(如颞下颌关节)和透明软骨(如膝关节)。近来对关节软骨的研究主要集中于透明软骨，而针对纤维软骨的研究较少。研究已经证明纤维软骨并不完全等同于透明软骨，两者具有生物学特性差异[4]。因此，本研究选取分别选取颞下颌关节和膝关节软骨，采用苏木精-伊红染(HE染)、甲苯胺蓝染、阿利新蓝染、番红O-阿利新蓝染、番红O染、番红O-快绿染等方法，分析比较不同软骨染方法在纤维软骨和透明软骨中的染差异，以期为今后软骨研究的染方法选择提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选用4周龄健康雌性新西兰大白兔3只，体质量约0.5 kg，由上海交通大学医学院附属第九人民医院动物实验中心提供。
1.2 主要试剂与仪器
甲苯胺蓝、阿利新蓝、番红O、快绿(Sigma，美国)；苏木精-伊红(HE)染液、4%甲醛、20% EDTA脱钙液(上海试剂一厂，中国)；粘附载玻片(Citoglas，中国)；光学显微镜(Olympus，日本)；数码照相机(Nikon，日本)。
么正杰1.3 髁突和股骨组织的分离、固定、脱钙和切片
采用耳缘静脉注射10 mL空气的方法处死4周龄新西兰大白兔；分别切取颞下颌关节髁突组织以及膝关节股骨组织，在PBS中将周围软骨组织分离干净；离体髁突组织和股骨组织立即置于4%甲醛溶液中固定24 h；次日取出样本置流水中冲洗5 h；将冲洗后的样本分组放入20% EDTA脱钙液中，7 d换液1次，脱钙处理2个月；脱钙完成后(即针头可无阻力穿过脱钙骨样本)，将样本标记并置于包埋盒中，流水冲洗过夜。
一滴清
分别对脱钙后的各组样本进行脱水、透明、浸蜡和包埋处理，并对每个样本进行5 μm 连续切片，白片以备染之用。
1.4 组织化学染
各组样本组织白片脱蜡至水，自来水冲洗后进行以下组织化学染。
HE染：苏木素染液中浸染3 min；流水冲洗10 min；1%盐酸乙醇分化数秒；流水冲洗返蓝10 min；伊红染液浸染3 min；流水冲洗10 min；二甲苯透明，中性树脂封片，镜下观察并拍照。
甲苯胺蓝染：1%甲苯胺蓝染液浸染60 min；流水冲洗10 min；冰醋酸分化数秒；流水冲洗；二甲苯透明，中性树脂封片，镜下观察并拍照[5]。
阿利新蓝染：pH 2.5的1%阿利新蓝染液浸染60 min；流水冲洗10 min；95%乙醇中洗去浮；流水冲洗；苏木素染液浸染3 min；流水冲洗10 min；1%盐酸乙醇分化数秒；流水冲洗返蓝 10 min；二甲苯透明，中性树脂封片，镜下观察并拍照[6]。
番红O-阿利新蓝染：0.5%番红O浸染3 min；流水冲洗10 min；pH 2.5的1%阿利新蓝染液中浸染60 min；流水冲洗10 min；95%乙醇洗去浮；流水中冲洗；二甲苯透明，中性树脂封片，镜下观察并拍照[7]。
番红O染：0.5%番红O浸染3 min；流水中冲洗10 min；95%乙醇中洗去浮；流水中冲洗；二甲苯透明，中性树脂封片，镜下观察并拍照[8-9]。
番红O-快绿染：1%快绿染液中浸染3 min；流水冲洗10 min；0.5%番红O浸染1 min；流水中冲洗10 min；95%乙醇洗去浮；流水冲洗；二甲苯透明，中性树脂封片，镜下观察并拍照[10]。
2 结 果
2.1 HE染
髁突纤维软骨各层结构清晰，从外到内依次为：纤维层、增殖层、成熟层和肥大层；髁突软骨表面光滑，纤维层着较淡，增殖层和成熟层呈弱嗜碱性(淡蓝)，肥大层软骨基质及软骨细胞呈强嗜碱性(深蓝)；股骨表面透明软骨染结果和髁突软骨类似，软骨基质
和软骨细胞为蓝，骨组织为红，但透明软骨的分层并不明显，肥大软骨细胞所占的比例较少；股骨生长板软骨细胞多为肥大软骨细胞，呈柱状排列，软骨基质呈嗜碱性(图1)。
2.2 甲苯胺蓝染
髁突软骨、股骨软骨和生长板软骨基质呈蓝紫，细胞核深染，骨组织不着；髁突软骨纤维层和增殖层着不明显(图1)。
2.3 阿利新蓝染
视频监控设计方案软骨基质着较浅，呈淡蓝，着不均匀，骨组织不着；股骨软骨着最浅，生长板软骨基质着最深，髁突软骨纤维层基本不着，增殖层着很浅，但肥大层软骨基质着较深，呈淡蓝(图1)。
2.4 番红O-阿利新蓝染
髁突软骨纤维层、增殖层软骨红染，成熟层和肥大层软骨软骨基质蓝染，骨组织呈淡红；股骨软骨和生长板软骨细胞周围均呈浅蓝，骨组织淡红(图1)。
图1 髁突、股骨表面软骨、以及股骨生长板各组织化学染结果( ×100)Fig.1 Histochemical staining of condyle, femur and growth plate( ×100)
资本运营论文2.5 番红O染
组织结构显清晰，髁突软骨细胞以及纤维层和增殖层软骨基质呈红深染，成熟层和肥大层软骨着相对较淡，呈红染；股骨软骨和生长板软骨基质着较淡呈橘黄，软骨细胞深染呈红 ，周围骨组织呈淡红(图1)。
2.6 番红O-快绿染
髁突纤维软骨分层结构显示明显，纤维层呈绿，增殖层和成熟层着较淡，肥大层呈红，软骨下临近骨组织着不明显；股骨软骨和生长板软骨呈淡红，骨组织呈深绿，软骨组织和骨组织分界清晰(图1)。
3 讨 论
软骨组织的正常结构对关节正常的生理功能具有重要的意义。关节软骨自身改建和修复能
力较弱，因此软骨缺损和病变的修复一直是组织工程领域的研究热点。近年来，国内外学者针对关节软骨做了大量的研究，在软骨组织学研究中主要采用本实验中的几种软骨染方法，研究对象也主要局限于透明软骨[8-13]。但是，针对各种软骨组织化学染的染原理，各种染方法在软骨染中的差异，以及在纤维软骨的研究甚少。因此，本研究选取透明软骨和生长板软骨作为对照，基于各软骨组织化学染原理，主要研究各软骨染方法的优缺点和髁突纤维软骨在各染方法中的特异性表现，以期为后期关节软骨研究提供实验依据和新思路。
软骨基质主要由胶原和蛋白多糖组成。研究发现胶原是软骨干重的主要成分，占50%～80%。在软骨基质中胶原类型主要包括：Ⅱ、Ⅲ、Ⅸ、Ⅺ型胶原[3,14]。胶原纤维以Ⅱ型胶原为主体，构成关节软骨基质的纤维骨架，并通过Ⅸ型胶原与蛋白多糖相连[15-16]。蛋白多糖对维持关节软骨正常的力学性能有重要意义。蛋白多糖单体通过连接蛋白与透明质酸主链相连形成蛋白多糖聚合体；蛋白多糖单体由核心蛋白和糖胺聚糖侧链组成；糖胺聚糖主要包括约100个硫酸软骨素和30各硫酸角质素(图2)[17]。大量的糖胺聚糖使软骨基质中富含阴离子基团，所以对软骨的染主要选用阳离子染料，如甲苯胺蓝、番红O等。
图2 关节软骨基质结构示意图Fig.2 The matrix structure of articular cartilage
石诗龙
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