高文卿;李彤;于美丽;段大为;胡晓旻;周淑芬;李鑫;刘东
【摘 要】The aim of this work is to prepare a new composite coating based on sodium alginate and heparin with aldehyde groups, and to evaluate the biocompatibility and hemocompatibility of extracorporeal circulation loop. The loop samples were divided into four groups; (1) blank control (C) , (2) sodium alginate (OSA) , (3) heparin (LMNH) , and (4) sodium alginate plus heparin (OSA. LMNH). The OSA and LMNH were bound to the surface of extracorporeal circulation loop by covalent linkage. Qualitative and quantitative analysis of polysaccharide fragments were conducted with FTIR and UV spectroscopy, the hemocompatibility of coated loop was evaluated by platelet adhesion, coagulation examination and protein adhesion, the hydrophily of coated loop was evaluated by surface contact angle. Experimental results showed that the surface of extracorporeal circulation loop was coated with OSA and LMNH. The platelet adhesion and thrombosis for the coated group were both decreased significantly compared with the non-coated group ( P ＜ 0. 05 ) .
大学生活导论
The protein adhesion of LMNH group has no significantly difference with the non-coated group. The protein adhesion of OSA group and OSA. LMNH group significantly decreased compared with LMNH group (P ＜0. 05). The anticoagulant property of LMNH group and OSA. LMNH group is good with significantly prolonged time of APTT and TT. The APTT time of OSA group is significantly prolonged compared with C group (p ＜0. 05). The surface contact angles of OSA and OSA. LMNH group is significantly decreased compared with C group(P ＜0. 05). The surface contact angle of LMNH group has no significantly difference with C group. Composite coating of polysaccharide fragments has improved anticoagulant property in reference to the control, and the hemocompatibility of the composite coating was obviously improved compared with single coating.%研制一种新型基于多醛基海藻酸钠和肝素的复合涂层,并就其生物相容性和血液相容性进行实验和评价.通过高碘酸钠氧化海藻酸及重氮化处理肝素获得多糖分子片段,多糖分子片段通过共价交联固定于体外循环管路表面.通过红外及紫外扫描对固定的多糖分子片段进行定性及定量分析；通过血小板粘附实验及蛋白粘附实验对涂层管道的血液相容性进行评价；通过表面接触角实验评价涂层管路的亲水活性；通过凝血功能检测评价管路表面的抗凝血活性.结果显赵天麟示:氧化海藻酸及重氮化处理后肝素在在管道表面固定确实；涂层组与未涂层组相比,血小板粘附量及血栓形成量均显著减少(P＜0.05)；肝素涂层组(LMNH)组与空白对照(C)组相比,蛋白粘附量无显著差异(P＞0.05)；海藻酸钠涂层(OSA)组、双涂层(OSA.LMNH)组与LMNH组相比,蛋白粘附量均显著减少(P ＜0.05)；LMNH组、OSA.LMNH组APTT及TT时间均显著延长(P＜0.05),抗凝血性能优良；OSA组与C组相比,APTT时间显著延长(P＜0.05)具有一定的抗凝血性能；OSA组、OSA.LMNH组与C组相比,表面接触角明显减小(P ＜0.05)；LMNH组与C组相比,表面接触角无显著差异(P＞0.05).实验结果表明,OSA涂层物具有更优的亲水性和抗蛋白粘附性,LMNH涂层物具有更优的抗凝血性能,多糖片段复合涂层综合了单涂层的优点,生物相容性和血液相容性较单涂层均明显改善.
【期刊名称】《中国生物医学工程学报》
【年(卷),期】流动性缺口2013(032)001
【总页数】8页(P78-85)
【关键词】海藻酸钠;肝素;终点固定;生物相容性;血液相容性
【作 者】高文卿;李彤;于美丽;段大为;胡晓旻;周淑芬;李鑫;刘东
【作者单位】天津市第三中心医院,天津300170
【正文语种】中 文
【中图分类】R318
引言
医学技术的发展推动了生物医学材料的研究和应用，如体外循环技术、透析技术及血滤技术的发展，急需相关生物医学材料的开发和应用，而有关生物医学材料的应用面临生物相容性及血液相容性两大问题。与血液接触的生物材料会激发宿主防御机制，特别是血液稳定机制，从而级联引起血栓和栓塞的发生，危及患者生命［1 -3］。改善生物医学材料的生物相容性有两种思路:其一是研发一种惰性表面材料可以避免激发宿主防御反应;其二是研发活性生物表面材料，自然控制宿主防御反应。涂层技术通过对材料表面的预改性，从而改善了生物医学材料表面的生物相容性和抗凝活性［4］，减轻术后的全身炎症反应［5］。 目前生物医学材料表面涂层原理可归纳为物理法和化学法［6］。物理法即通过机械包埋、分子链之间的缠绕和渗透、被有孔材料吸附等方式将涂层物固定到生物材料表面，从而达到将涂层物固定化的目的。化学法即通过涂层物分子链上丰富的反应性官能基团，如磺酸基、氨基、羧基等与目标材料表面上相应的可反应基团进行反应，以离子键或以共价键的方式将之固定到生物材料表面［7 -8］。本研究利用高碘酸氧化、重氮化处理和终点固定技术，提供了一种由多醛基海藻酸和重氮化处理后肝素组成的多糖分子片段复合涂层的制备方法。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
海藻酸钠(A2158，Sigma)，高碘酸钠(311448，Sigma-Alorich)，聚乙烯亚胺(PEI，181978，Alorich)，氰 基 硼 氢 化 钠(71435，Fluka analytical，Sigma-Alorich)，苯酚(国产分析纯)，亚硝酸(S2252，Sigma-Alorich)聚氯乙烯管路(东莞科威医疗器械有限公司，中国)，人血清白蛋白(贝林CSL Behring GmbH，德国)，人纤维蛋白原(MW341000，CALBIOCHEM，EMD Chemicals，美国)，肝素钠(150IU/mg，安徽金鑫生物，中国)。
红外分光光度计(NICOLET 6700，Thermo，美国)，紫外分光光度计(UV -2800，日立，日本)，凝血自动分析仪(STA-R Evolution ©，Diagnostica Stago，法 国)，血 细 胞 分 析 仪 (ADVIA2120，SIEMENS，德国)，BCA 蛋白定量试剂盒(SK3021，上海生工，中国)，扫描电镜(Phenom，FEI Company，美国)，表面接触仪(OCA15EC，Dataphysics，德国)。
1.2 方法
1.2.1 涂层物的制备
1.2.1.1 肝素(LMNH)涂层物制备
将肝素钠粉剂充分溶解于去离子水中，并加入亚硝酸钠，在酸性环境下0℃反应2 h，后调定溶液pH 值至7.0 以中止反应，得到LMNH 溶液。7 000 Da 透析袋透析过夜后冷冻，利用低温真空干燥机进行干燥，获得LMNH 粉末。
十二五科技成就展
傻博士1.2.1.2 海藻酸钠(OSA)涂层物的制备［18］
将海藻酸钠充分溶解于去离子水中，加入高碘酸钠，常温避光反应24 h，后于反应液中加
入乙二醇终止反应。反应液中加入NaCl，混匀后缓慢倒入96%乙醇中，析出的沉淀物经抽滤、干燥后，再次溶于去离子水中，3 500 Da 透析袋透析过夜后冷冻，低温真空干燥后获得OSA 粉末。
1.2.2 表面预处理及表面修饰
如图1 所示，首先用H2SO4·K2 MnO4 溶液分别对聚氯乙烯管道进行酸化预处理，在材料表面形成羧基(—COOH)，与强阳性聚乙烯亚胺的氨基(—NH2)结合在材料表面，构建大量以氨基为主的“空间臂”，增加结合位点，然后与重氮化处理后肝素末端的醛基(—CHO)和氧化海藻酸钠末端的醛基结合，制成共价键结合涂层材料。
图1 预处理及表面修饰模式图Fig．1 Pretreatment and surface modification
大卫科波菲尔论文1.2.3 涂层表面形貌分析
涂层后聚氯乙烯管路充分干燥，样品表面喷金，后扫描电镜观察涂层前后材料表面形貌变化。
1.2.4 涂层表面功能基团特性分析
涂层后聚氯乙烯管路充分干燥，剪开管路暴露内表面，红外扫描探头直接检测涂层管道表面功能基团。海藻酸钠及肝素标准品红外定性均采用溴化钾压片模式。检测器DTGs KBr，分束器KBr，波长范围650 ～4 000 nm。
1.2.5 表面涂层物密度的检测
1.2.5.1 肝素固定密度的测定
采用甲苯胺蓝定量方法，参照文献［9］方法建立肝素浓度标准曲线。待测涂层材料分别剪成10 cm2小碎片，加入20 mL 试管中备用;试管内依次加入2.5 mL 质量分数为0.02% 的甲苯胺蓝溶液和2.5 mLPBS 溶液，震荡混匀，室温下反应50 min;后抽取反应液，利用紫外分光光度计测量630 nm 处Abs 值，并根据标准曲线推算涂层密度。
肝素涂层密度(μg/cm2)= 肝素测定浓度×5 mL/10 cm2
1.2.5.2 海藻酸钠固定密度的测定
采用苯酚-硫酸法测定，参照文献［10］方法建立海藻酸钠浓度标准曲线。分别留取反应前
后OSA 溶液，硫酸苯酚法处理后利用紫外分光光度计测量480 nm 处Abs 值，根据海藻酸钠标准曲线，利用差值法计算等价于葡萄糖标准品的涂层密度
海藻酸钠涂层密度(μg/cm2)= 2(反应前浓度-反应后浓度)/10 (1)
1.2.6 涂层表面亲水性实验
微量进样器干燥后样品表面滴加2 μL 纯水，用动态接触角测量仪记录接触角随时间的变化，每个样品每次测量5 个点，每点计量10 次取平均值。通过测定涂层前后材料表面接触角的变化，来表征涂层的亲水特性。实验数据由SCA 202 软件进行进一步分析。
1.2.7 涂层表面蛋白吸附实验
涂层表面粘附蛋白的定量采用BCA 法，依据文献［11］及BCA 试剂盒方法建立蛋白浓度标准曲线。将待测样品剪成0.5 cm ×0.5 cm 碎片，加入24 孔培养板;配置0.2 mg/mL 人血清白蛋白(human plasma albumin，HAS)和人纤维蛋白原(human protein fibriogen，HPF)稀释液;配置BCA 工作液;向放置待测样品的培养孔中，分别加入1.5 mLHSA 和HPF 稀释液，将材料完全浸没，放入恒温水箱中，37℃孵浴1 h;将孵育后蛋白液全部取出，加入离心管
中震荡混匀后待测;取100 μL 待测蛋白液，加入洁净的离心小管中，同时加入BCA 工作液1 mL，再次震荡混匀后，60℃恒温孵浴30 min;利用紫外分光光度计测定孵浴后混合液在562 nm 波长处Abs 值，根据标准曲线，计算反应前后蛋白差值，即为材料表面蛋白粘附量。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议