-基础研6•
何江枢1!，陈林1!，刘迅2，董陶涛2，何平林2，罗旭X陈书练X杨进1!
(1.遵义医科大学附属医院，贵州遵义563000#.成都大学附属医院泌尿外科，四川成都610081) Ananimalstudyonthediagnosisofinterstitialcystitisbybladderpuncture HEJiangshu1，2，CHEN Lin1，2，LIU Xun2，DONG Taotao2，HE Pinglin2，LUO Xu1，CHEN Shulian1，YANGJin1，2
(1A f iliated HospitalofZunyiMedicalUniversity，Zunyi563000#2DepartmentofUrology，A f iliated Hos-pitalofChengdu University，Chengdu610081，China)
ABSTRACT Objective To construct a dog model to explore the pathophysiological proce s of interstitial cystitis.Methods A total of6male beagle dogs were randomly divided into control group(o=3)and experimental group(o=3).Under pentobarbital sodium anesthesia,normal saline and cyclophosphamide(CYP)solution were infused into the bladder through silicone catheter(F12)once a week for3weeks.Ultrasound-guided bladder biopsy was performed in the4th week.Bladder puncture tissues were fixed wth40g/L paraformaldehyde solution.HE staining and mast cells infiltration were obser
ved.Results Com-paredwiththecontrolgroup，theexperimentalgroupshowednosignificantchangeinti s ueintegrity，butsignificantchronicin-flammatoryce l infiltration and ti s ue fibrosis，and increased proportions of macrophages，lymphocytes and mast ce l s. Conclusion Theanimalmodelofinterstitialcystitiscansimulatenotonlytheproce s ofinterstitialcystitisbybladderpuncture，butalsotheoccurrenceanddevelopmentofinterstitialcystitis.
KEY WORDS:bladder puncture；interstitial cystitis；dog；cyclophosphamide；animal model
摘要：7的构建新的间质性膀胱炎(IC)实验犬模型深入研究膀胱间质性炎症疾病的病理生理过程。9：将6只雄性比格犬随机分成两组，对照组和实验组各3只。在钠麻醉下，利用儿童硅胶导尿管(F12)分别向对照组及实验组犬膀胱内灌注生理盐水和环磷酰胺(CYP)溶液，每周灌注1次，维持3周°在第4周行超声引导下膀胱活检穿刺，并用40g/L多聚甲醛溶液固定膀胱穿刺组织，观察实验组与对照组膀胱HE染及肥大细胞浸润情况。结＜组织染结果显示实验组与对照组相比，膀胱上皮组织完整性无明显改变，无慢性炎症细胞浸润、组织纤维化的表现，其中巨噬细胞、淋巴细胞明显增加，每平方毫米内肥大细胞的数量明显增多。结+犬作为一种新的间质性膀胱炎动物模型，不仅能够模拟膀胱穿刺诊断人类IC过程，而且也能更好地模拟人类IC的发生、发展过程。 关键词：膀胱穿刺；间质性膀胱炎；犬；环磷酰胺；动物模型
中图分类号:R694.3文献标志码:A DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.202102.016
间质性膀胱炎(interstitial cystitis,IC)，也称膀胱疼痛综合征(bladder pain syndrome,BPS)是一种以持续性疼痛为特征的综合征，与膀胱有关，伴有尿频或尿急，临床表现多种多样/10。基于人口研究表明，女性与男性的比例大约为5：1，甚至较高，并且通常伴发睡眠功能障碍、焦虑、抑郁和性功能障碍，严重影响患者的生活质量根据一些研究报道，IC 与自身免疫、感染、上皮损伤、毒素和肥大细胞浸润等
收稿日期：2020-05-19修回日期：2020-11-19
通信作者：杨进，教授，主任医师，硕士研究生导师.
E-mail:yangjindoctor@gmailcom#
陈林，副教授，副主任医师，硕士研究生导师.
E-mail：767419466@qq，系共同通信作者
作者简介：何江枢，硕士研究生在读•研究方向：梗阻性膀胱疾病基础研究.E-mail：2251705912@qq 因素存在一定关联
环磷酰胺(cyclophosphamide,CYP)作为IC造模中最常使用的一种药物，CYP模型概括许多IC/ BPS的典型特征，不仅造成的炎症效果较好，而且在稳定性上具备明显优势，得到国内外的广泛认可⑷。但CYP通常用作腹腔注射，并未直接接触到膀胱黏膜，因此造成的炎症效果可能不是最佳的。而IC造模的实验动物与以往比较几乎无变化，犬用作IC造模的报道少之又少。因此本研究在CYP模型基础上，导尿(F12)向犬内
注CYP溶液来建立IC模型，同时模拟膀胱穿刺诊断人类IC的过程，这可能为研究和诊断IC提供一个全的动物型'
1材料与方法
1.1实验动物雄性比格犬6只（6〜8个月，10〜15kg），购自成都实验动物有限公司。所有比格犬均在同一认证设饲养，环境、湿度和温度都有制，光i暗周期为12i12h o在的实条件下，每个笼子1只，自主获得食物。所有的实程实验设计都是按照美立卫生研究院的《实验动物护理和使南》进行的。成都大学附属医院伦理委员会批准所有动物实验（许可证号:LL/ KY-201502-03）o为尽可能减少动物的痛苦，所有手术都是在肌肉注射钠$0mg/kg））进行的。
1.2实验设计将6只雄性比格犬按完全随机设计法分成对照组5=3）、实验组！=3），肌肉注射钠$0mg/kg）麻醉后，对照组通过儿童硅胶导尿管（F12）向内灌注生理盐水30mL，实验组通过儿
童硅胶导尿管（F12）向膀胱内灌注CYP（0.2g）溶液30mL，每注1次，维持3周。在第4周使一次性活检穿刺针在导下经腹部皮肤逐层穿刺全层，并用40g/L甲醛溶液匡穿刺组织，观察实验组与对照组膀胱组织染及肥大况。此外，当出现严 尿、尿量减少时，我们根据这些，
过度损伤的恶化程是否进行人道终止。在所有实验结束后，我们用钠对犬实 乐死。
1.3导尿及膀胱灌注的方法因造模试剂CYP必须进方期，注操作是本实验所必须的操作。将犬用钠$0mg/kg）麻醉后，腹部向上置于实验台，固定四肢，嘴用特制嘴套。将耻骨前方皮皮，暴露尿道口，棉尿道口皮肤/50。导尿管（F12）作为犬导尿管。导尿管前段用石蜡润滑后沿尿道口，当见有尿出已进細光。连接注抽内尿液，力度需损伤。之后可选择生理盐磷酸盐缓冲液进行膀肋
实验的可靠性「60。换注 剂CYP注入，灌注制在22L/s损1膀胱输尿的发生「60。
1.4组织HE染在灌注后第4周使用一次性活
科学家发现迄今最小恐龙穿刺在导经腹部皮肤逐穿刺
全层后，将穿刺的组40g/L甲醛溶液固定后梯度乙醇脱水，石蜡包埋、切片（5ptm），进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染，显微镜观察 况。
1.5组织甲苯胺蓝染将膀胱组织用40g/L多聚甲醛溶24h，常规脱水、包埋。石蜡切片经甲苯胺（甲苯胺蓝0.2g，体60%的乙醇50mL）染，脱水、透明，中性树胶封片，并采用Image-pro plus 6.0（Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA）软件进行分析。
2结果
2.1膀胱组织HE染对照组可以看到膀胱黏膜上皮完整，没有的损伤；实验组在CYP刺激后可到上皮破坏、脱落，增厚,
增多（图1），说明CYP造成的效比。
A：对照组；B：实验组。
图1对照组和实验组4周组织（HE,X30）
2.2肥大细胞特殊染IC是一种慢性无菌性膀胱炎症，其病理上无特异性表现，与一慢：症唯一的特征性区别是组的肥大细，并呈脱颗现「7「80。因此本实甲苯胺：剂检测组脱颗粒肥大的况来检犬模型到预期结果。从图2中我们［看出，周围组织背景清晰，实验组与对照组相比肥大细增多，红箭头所肥大。通过
Image-proplus6,0（MediaCybernetics，Inc,，Rock-vile,MD,USA）软件进行分析计算每平方毫米内肥
大细胞的数量（表1）o
振动与冲击
A：对照组；B：实验组。
图2对照组和实验组第4周穿刺膀胱组织（甲苯胺蓝染，X40）
表1实验组和对照组每平方毫米内肥大细胞的数量组别肥大细胞数（个/mm2）
实验组132.78503280
实验组220.67080482
实验组322.80424353
对照组112.06650769
对照组215.42825123
同质化对照组315.74132677均用甲苯胺蓝染%X400视野下统计。
3讨论
虽然当前细胞生物学和分子生物学等研究方法高速发展，然而为了观察和检测机体的协调活动和整体状态，使用动物模型模拟病理状态的方法仍然是必不可少的「90。在过去的几十年，大约有20多种动物模型制备出来，而以往报道了一些IC的实验动物模型在制作上仍存在一些不足之处。例如，当前较新颖的是通过向大鼠膀胱灌注10mg硫酸鱼精蛋白+ 7502g脂多糖，但鱼精蛋白这类物质是非选择性的，会破坏细胞膜，导致细胞裂解[10-11];IZGI等「12-130通过向小鼠注射UPK3A65-84肽或伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）诱发主要的IC表型，其效果较好，但由于UPK3A6584肽制备成本较高，PRV稳定性较差，因此未得到大面积推广。尽管最常用的实验动物鼠，从一定程度能模拟人体，但是对于IC膀胱内药物滴注模型而言，需要反复经尿道灌注药物，而鼠尿道狭窄，特别是小鼠从操作
韩素音
上来说有一定的操作难度及尿道狭窄可能/00。猫科动物由于病因不明确，以及后期处理和维持的成本相对较高，因而使用受限「140。再加上人类状况本身的复杂性，几乎现有动物模型都不能完全重现人类的所有症状，而只能更加接近地模拟IC的病理生理/4「150o
对于IC模型，目前造模方式比较符合人们对于IC认知的是膀胱内药物滴注模型。这类模型通过导管或者导尿管直接将药物送至膀胱，作用于膀胱黏膜引起炎症，机理简单，成本较低，能够很好地还原人类IC的表型，但一般表型维持时间短，因此需要多次灌注「160。而有研究表明，CYP作为最常用的造模药物，反复给予低剂量CYP，可以很好地诱发IC患者的疼痛症状及下尿路症状，而不会出现出血等病理改变「17「180。根据国内外相关报道，此类模型应用最多，是一种经过充分研究的模型，其在稳定性及可操作性上具备独特优势。因此本研究将造模药物CYP与膀胱内药物灌注造模方式相结合。同时本文以犬作为实验动物，既能够诱导出慢性炎症，延长表型维持时间，也能解决因小鼠尿道插管引起的尿道损伤、狭窄、炎症及存在的技术问题，以及长期注射CYP后引起小鼠膀胱尿路上皮增生、改变等病理问题。在实验中，我们还模拟膀胱穿刺诊断人类IC的过程，在将犬麻醉和皮肤消毒后，通过超声引导下经腹部皮肤逐层穿刺至膀胱全层，这样使取得的膀胱组织更加符合人类组织活检的临床过程。
在本研究中，我们建立了一种新的IC动物模型，这种新的模型与人类IC的临床和组织病理学特征非常相似，通过与对照组相比发现具有以下特点：膀胱壁全层慢性炎症细胞浸润，尿路上皮变薄或部分缺
失，肥大细胞浸润明显。然而，实验仍存在一些不足之处，例如使用一次性活检穿刺针穿刺膀胱组织仍有到组的%样成实不
或得出错误的数据。此外，由于穿刺针逐层取得的膀胱组织往往比较细小，因此做组织切片时层次可能被破坏，影响实验的结果。犬作为实验动物，虽然与鼠相比在操作上有一定优势，但犬的经济成本较高，且犬在实验过程中不易控制，有一定危险性。我们在接下来的实验中将对这些不足之处做进一步改进和优化。
根据目前研究结果，犬膀胱内CYP诱导的IC模型可能是一种相对持久的膀胱炎模型，能够更好地反映膀胱炎的病理发生发展过程。因此，建立一种有效的IC/BPS模型对其潜在的方法的检测具有重要意义。
本研究表明通过间歇性地向犬膀胱内灌注CYP 可诱导膀胱产生相对持久的炎症，组织中慢性炎症细胞浸润，其中肥大细胞浸润明显，而且这种新的慢性膀胱炎模型与人类BPS的临床和组织病理学特征有较高的相似度。因此，我们建立的CYP诱导的犬膀胱炎模型不仅能够模拟膀胱穿刺诊断人类IC过程，而且也能更好地模拟人类IC的发生、发展过程，它有可能成为BPS等慢性膀胱炎的病理研究和诊断的一种潜在的有价值的模型。
参考文献：
/I]MALDE S,PALMISANI S,AL-KAISY A,et al.Guideline of guidelines：bladder pain syndrome[J].BJU Int,2018,122(5)：729-743.
WANG X,DENG XJ.Research progress of bladder pain syn-drome/interstitial cystitis/J].J Clin Exp Med,2018,17(20): 2235-2238.
LUO J,YANG CF,LUO X,et al.Chlorogenic acid attenuates cyclophosphamide-induced rat interstitial cystitis[J].Life Sci, 2020254：117590.
/]昂小杰，李淼，周峰，等.间质性膀胱炎动物模型的研究进展/]•中国实验动物学报，2020,28(1)!48-152.
/
]张威，孟令峰，刘晓东，等.大鼠间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征
模型建立的研究进展/]•中国实验动物学报，201927(5) =673-677,
/]金兴魏，邵远.膀胱疼痛综合征的小鼠模型研究/].中华腔镜泌尿外科杂志(电子版)2015,9(6):458-462.
/]吕坚伟，沙建军，张连华，等.硫酸鱼精蛋白联合脂多糖构建间质性膀胱炎动物模型的研究:J].上海交通大学学报(医学版), 201232(4)：385-388新年献词事件
[8]BAE WJ,HA US,KIM S,et al.Reduction of oxidative stress
mayplay a rolein the anti-inflammatory e f ect ofthe novel herbalformulationinarat modelofhydrochloricacid-induced cystitis[J],NeurourolUrodyn201534(1)：86-91,
/]王永权，熊智勇，龚薇，等.尿道外口皮下注射透明质酸建立大鼠
膀胱出口梗阻模型及效果评价/]•现代泌尿外科杂志，201520
(1)：48-51,
[10]RYU CM%YU HY%LEE HY%etal,Longitudinalintravitalima-
gingoftransplanted mesenchym alstem ce l selucidatestheir functionalintegration and therapeutic potency in an animal
modelofinterstitialcystitis/bladderpain syndrome[J],Ther-anostics20188(20)：5610-5624,
[11]BIRDER L%ANDERSSON KE,Animalmode l ingofinterstitial
cystitis/bladderpain syndrome[J],Int NeurourolJ%2018%22 (Suppl1)：S3-S9,展璞计划
[12]IZGI K,ALTUNTAS CZ,BICER F,et al.Uroplakin peptide-spe
cific autoimmunity initiates interstitial cystitis/painful bladder syndromeDn mDce[J].PLoSOne20138(8)：e72067.
[13]YANG W%YAGGIE RE%JIANG MC%etal.Acyloxyacylhydro-
lase modulates pelvDc paDn severDty[J].Am J PhysDol Regul In-tegrCompPhysDol2018314(3)：R353-R365.
[14]BUFFINGTON CA%PACAK K.Increased plasma norepDneph-
rDneconcentratDonDncats wDthDntersttDalcystts[J].J Urol%
2001165(6Pt1)：2051-2054.
[15]Kwon WA.AnDmal ModelofIntersttDalcystDtDs/bladder paDn
syndrome[J].IntNeurourolJ201822(Suppl1)：S1-S2.
[16]LV YS%YAO YS%RONG L%etal.IntravesDcalhyaluronDdase
causeschronDc cystDtDsDn a rat model：a potentDal model of bladderpaDnsyndrome/DnterstDtDalcystDtDs[J].IntJ Urol%2014% 21(6)：601-607.
[17]GOLUBEVA AV%ZHDANOV AV%MALLEL G%et al.The
mousecyclophosphamDdemodelofbladderpaDnsyndrome：tssue
characterDzatDon%Dmmuneproflng andrelatDonshDpto metabotro pDcglutamatereceptors[J].PhysDolRep20142(3)：e00260. [18]MA F%KOUZOUKAS DE%MEYER-SIEGLER KL%etal.MIF
medDatesbladder paDn%notDnflammaton%Dn cyclophosphamDde cystDtDs[J].CytokDneX20191(1)：100003.
(编辑郭楚君)
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