将带有目的条带的琼脂糖凝胶，在紫外灯下用已灭菌的刀片,延条带边际仔细切割条带(切割胶块时动作要快，在紫外灯下暴露的DNA易降解，在切胶时尽量一个一个的切，每切一次，关闭紫外灯)。 然后将其放入商品纯化柱内，进行片段纯化。（具体方法步骤按照AXYGEN纯化试剂盒说明操作）
(1)计算凝胶重量，以该重量作为一个凝胶体积，加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合（每2-3min），直至凝胶块完全融化。
(2)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。
(3)吸取上述步骤中的混合液，转移到DNA制备管中，12000×g离心1min.弃滤液。
(4)将制备管置回2ml离心管，加500ulBuffer W1，12000×g离心30s，弃滤液。
(5)将制备管置回2ml离心管，加700ulBuffer W2，12000×g离心30s，弃滤液。
(6)重复（5）。
(7)将制备管置回2ml离心管，12000×g离心1min。（空离）
(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加25~30ulEluent或去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。
(9) 跑胶观察是否有纯化结果。
(10) 纯化产物放-20℃保存，备用。
2.扩增片段的克隆
纯化的片段连接到克隆载体pMD19-T vector，转化导入宿主菌大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选，获得含所需要的目的片段的质粒。
2.1 扩增片段3’端加“A”尾（此步骤一般不用）
反应体系：
10×Buffer 1μl
MgCl2 (25mM) 1μl
dATP (10mM) 1μl
纯化的PCR产物 5μl
Taq酶松江清真寺(5U/μL) 1μl
ddH2O 补齐10μl
混匀，瞬间离心，收集到管底。70℃保温30min，取2μl进行连接反应。
2.2目的片段与克隆载体的连接反应
按下列顺序在冰上加入各种成分，建立连接反应。
SolutionⅠ 2.5ul
pMD19-T vector 0.5 ul
目的片段 1.5 ul-2ul
加水补齐 5 ul
轻轻吹吸混匀，16℃循环水浴连接过夜。（可直接加目的片段2ul）
(1)从于37℃培养16至20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有30ml LB液体培养基的试管中，于37℃过夜培养；（可以少点，30ml浪费）
(2)然后按1％的接种量接种至含有100ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，振荡培养2至3小时（摇床转速为200转/零点冲动分）；（OD600值约为0.3~0.4之间）
(3)在无菌条件下将50ml细菌转移到一个无菌、冰预冷的50ml离心管中，在冰上放置10分钟，将培养物冷至0℃，以8000rpm 4℃离心3分钟，以回收细胞； (4)倒出培养液，用2ml冰冷的0.1 mol/L CaCl2重悬沉淀，再加入8ml冰冷的0.1 mol/L CaCl2 ，8000rpm 4℃离心3分钟；
(5)倒出上清液，用2ml 冰冷的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀；再加入40％预冷的无菌甘油2ml，
用冰冷的无菌吸头从感受态细胞悬液中按每管（1.5ml离心管）取150μL，立即放入-70℃低温冰箱中保存备用。
2. 4 大肠杆菌的转化
(1)从低温冰箱中取150μl感受态细胞，置于冰上使其融化。（不要长时间露于冰面以外，同时已经融化的感受态细胞不宜再冻入冰箱下次使用，因此，在取感受态的时候，要注意保证不要让其他感受态融化）
(2)加入5μl的连接产物至融化好的感受态细胞悬浮液中，用手轻弹几下，使之混匀，然后置于冰上30min。
(3)制备X-gal(每9cm平皿加40μl，20mg/mlX-gal)/ IPTG(每9cm平皿加6.7μl, 0.5M IPTG )Amp(100ml液体LB加入200ul，25mg/ml的Amp)板，正置于37℃温箱中3个小时。（经验：可放置1h左右）
(4)从冰上取出感受态和DNA混合物，42℃热激90s，立即冰浴2min。
(5)每管加600μl不含抗生素的LB液体37℃，在摇床中恢复培养1.5至2h。
(6)将菌液进行离心，去上清，留100ul左右重悬沉淀，全部涂布在还有Amp, X-gal, IPTG的LB固体平板上，37℃温箱正置吸收30min左右，倒置培养16小时。 （涂布过程中要注意以下几点：1.涂布X-gal，IPTG时要尽量快，否则涂不开效果不好；周施雄2.涂布菌液时涂布开即可，不可用力涂以及涂布时间过长，可能会压碎细胞；3.要注意无菌操作。）
2. 5 重组子的筛选
进行蓝白斑筛选，随机挑取白重组菌落于含有Amp抗生素2.5ml液体LB培养基中培养过夜。
2. 6 大肠杆菌质粒DNA的小量制备
质粒提取
(1) 保存菌种，40%甘油：菌液=1：1。（一般保存600ul菌液，加上600ul甘油）
(2) 用1.5ml挑过夜的菌液，12000rpm离心2min，收集菌体，弃上清。（保存菌种后，剩
下的都可以做质粒提取）
(3) 沉淀用1ml STE溶液重悬菌体，洗涤，12000rpm离心1min，弃上清，控干。（这一步可以省略）
(4) 加入100μl溶液，重悬沉淀。
50mmol/L 葡萄糖（只做酶切鉴定的可以不加葡萄糖）
SⅠ 25 mmol/L Tris·Cl （pH8.0）
10mmol/L EDTA （pH8.0）
(5) 加入200μl溶液Ⅱ。轻轻混匀
2% SDS：0.4M NaOH=1:1 现用现配
泛裸体
(6) 加入150μl溶液Ⅲ，轻轻颠倒混匀，冰浴10min。
5mol/L乙酸钾 60ml
S民粹Ⅲ 冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
SⅠ，SⅢ需要冰浴。
(7) 12000rpm离心10min，移上清至新管中。（约350ul）
(8) 加入等体积酚，氯仿（1：1）振荡，12000rpm离心4min，移上清至新管中。
(9) 二倍体积无水乙醇，-20℃醇沉20min， 12000rpm离心10min。
(10) 再用70%乙醇洗涤，12000rpm离心5min。
(11) 干燥，用20ul TER溶解。（现配）
(12) 电泳验证。
2.7 通用引物验证
PCR体系为25ul
Taq Buffer 2.5ul
Taq 酶 0.2ul
dNTP 1ul
SPR 1ul
SPF 1ul
模板（质粒稀释50倍） 1ul
水 补齐至25ul
反应程序：94℃ 2min
94℃ 1min
65℃ 30s 25cycle
72℃ 1min
72℃ 5min
4℃无限循环
2.8 酶切验证
根据pMD19-T vector结构，选择BamHⅠ风中的铃铛和HindⅢ进行双酶切。
质粒 2μl
BamHⅠ 0.25μl
HindⅢ 0.25 μl 10μl
10×K Buffer 1μl
ddH2O 6.5μl
37℃温浴 4小时。
1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。
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