猪流行性腹泻病毒S1-NTD蛋白表达及其免疫原性研究 SUN Pei;ZHANG Juan;SHU Jinqi;SHI Xingfen;FAHD;SHU Jianhong;QIAN Hong
台海问题
【摘 要】[目的]在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1 NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础.[方法]PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD.将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD.将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度.在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况.将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况.[结果]PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD.利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDVS1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高.在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P＜0.05),而PBS和空载体Bacmid对照组淋巴细胞未发生明显增殖(P＞0.05).[结论]成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性.
【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2019(047)009
【总页数】8页(P17-24)
【关键词】猪流行性腹泻病毒;S1蛋白;昆虫杆状病毒表达系统;免疫原性;基因工程疫苗
【作 者】SUN Pei;ZHANG Juan;SHU Jinqi;SHI Xingfen;FAHD;SHU Jianhong;QIAN Hon
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【作者单位】
【正文语种】中 文
【中图分类】Q786;S852.4+3
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻病(porcine epidemic diarrhea,PED)具有高致病性、高死亡率等特点，且在世界范围内广泛分布[1]。1978年，比利时首次确认PED的病原[2]，此后该病在匈牙利、德国、日本、中国、韩国、越南等多个欧亚国家相继发生[3]。2013-2014年，美国、加拿大、古巴、墨西哥和日本出现PED疫情[4-5]。PED在我国部分地区时有发生和流行，且多为混合感染爆发，给养猪业带来了巨大的经济损失[6-7]。疫苗接种是预防和控制PED的主要手段，目前市场上的疫苗多为传统的弱毒疫苗或灭活疫苗，而该类疫苗在安全性等方面存在诸多隐患[8-9]。基因工程疫苗可有效解决传统疫苗存在的问题，所以研究开发新型PEDV基因工程疫苗具有重要的意义。
PEDV病毒囊膜上的纤突(S)蛋白[10-12]，属于I型糖蛋白，呈辐射状连接在病毒粒子囊膜表面上，是病毒的主要抗原，负责与宿主细胞的受体结合；同时PEDV S蛋白也是诱导病毒产生中和抗体的主要抗原。在病毒侵染靶细胞时，S蛋白与靶细胞膜上的相应位点结合，通过膜融合进入细胞内部，从而调节中和抗体的产生[13-14]。因此S蛋白被认为是基因工程疫苗研究的关键候选抗原。编码PEDV S蛋白的基因序列大小约4 125 nt，编码1 383个氨基酸，蛋白分子质量180～220 ku。PEDV S蛋白可以分为2个区域：S1区(1～789位氨基酸)和S2区(790～1 383位氨基酸)，其中S2蛋白较为保守，而S1蛋白变异较大，也是S蛋白主要的功能区[15]。S1蛋白包含N端结构域(N terminal domain,NTD)和C端结构域(C terminal domain,CTD)，这2个结构域都可能作为受体结合区(RBD)识别不同的细胞蛋白和糖,而诱导中和抗体产生的表位位于RBD内[16]。
杆状病毒是昆虫的病原体，其所具有的一些典型特征(如在晚期基因高水平表达)使其非常适合作为外来基因表达的载体[17-18]。为推进PEDV基因工程疫苗的探索和创新，本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达PEDV S1-NTD蛋白，并验证了其免疫原性，旨在为利用昆虫杆状病毒表达系统制备PEDV基因工程亚单位疫苗提供依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
pFastBac Dual载体、大肠杆菌K-12菌株TG1、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DH10Bac、昆虫细胞sf9，均由浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室保存。6周龄BALB/c小鼠，由杭州玄竹生物科技有限公司提供。
PCR高保真酶混合液、Cellfection Ⅱ转染试剂(Invitrogen，美国)，DNA Marker (BioLabs，美国)，DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、PCR清洁回收试剂盒(QIAGEN，德国)，Quick-Cut限制性内切酶(Takara，大连)， SF-900IISFM培养基(Gibco，美国)，鼠源Flag单克隆抗体、鼠源抗His6单克隆抗体(Roche，瑞士)，刀豆蛋白ConA(Sigma，美国)，PEDV商业疫苗(浙江诗华诺倍威有限公司，杭州)，HRP-羊抗小鼠单克隆抗体(Abcam，美国)，小鼠淋巴细胞分离液(达科为生物技术有限公司)，PEDV酶联免疫试剂盒(Andy，美国)。
1.2 PEDV S1-NTD基因PCR的扩增
利用DNAstar软件设计S1-NTD基因扩增引物，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
引物序列：PEDV S1-NTD For：5′-TCCCCCGGGATGCATCACCATCACCATCACGGCCAGTCCCTA-
GCTTT-3′(下划线碱基为SamⅠ酶切位点)；PEDV S1-NTD Rev：5′-GGGGTACCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGTAGCACTGACAAATC-3′(下划线碱基为KpnⅠ酶切位点)。
以PEDV S基因(由浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室保存)为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：PCR高保真酶混合液45 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)各2 μL，DNA模板1 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共25个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.3 重组表达质粒和穿梭质粒的构建及鉴定
将扩增出的PEDV S1-NTD基因进行SamⅠ/KpnⅠ双酶切,然后与经同样双酶切的pFastBac Dual载体连接，转入TG1感受态细胞中，构建出pFastBac Dual PEDV S1-NTD重组表达质
易趣 淘宝粒，将连接产物转化大肠杆菌DH5α后的菌液涂抹至含0.1 mg/mL氨苄青霉素的培养板上筛选阳性克隆，摇菌提取质粒后进行SamⅠ/KpnⅠ双酶切、PCR扩增和测序鉴定。
太中银将构建成功的pFastBac Dual PEDV S1-NTD重组表达质粒转化DH10Bac菌，与其中的Bacmid质粒进行同源重组，得到重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD，并进行蓝白斑试验筛选。设计引物M13 F：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′，M13 R：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以蓝白斑试验筛选的阳性重组质粒为模板，用M13F/M13R、M13F/PEDV S1-NTD Rev、M13R/PEDV S1-NTD For、PEDV S1-NTD For/PEDV S1-NTD Rev对重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD进行PCR鉴定。
duzhe1.4 重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD的构建
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将鉴定正确的重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD感染sf9细胞，观察细胞的发病状态。收集感染的sf9，用细胞与上清中的P1代重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD再次感染sf9细胞，获得P2代重组杆状病毒，用空斑试验测定其滴度。用其感染sf9细胞，48 h后收集细胞，用细胞裂解液裂解后取上清液，用10%的SDS-PAGE电泳分离细胞总蛋白，以鼠源抗His6单克隆
抗体为一抗进行Western blot试验，验证重组蛋白S1-NTD在sf9细胞中的表达情况。
用密度为1×106 mL-1的处于对数生长期的健康sf9细胞铺六孔板，27 ℃静置1 h，将P2代重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为0.1感染sf9细胞，于感染后第1，2，3，4,5和6天收集细胞上清液，用空斑试验测定病毒滴度，进而绘制重组杆状病毒的增殖曲线。
1.5 目的蛋白PEDV S1-NTD在sf9细胞中的表达量
将MOI为0.1，1和3的P2重组杆状病毒分别感染sf9细胞，于感染后第1，2，3，4和5天分别收集细胞(MOI=3时，第5天的细胞大量死亡，故未收集细胞样品)，PBS洗涤后用细胞裂解液裂解后取上清液，以鼠源抗His6单克隆抗体作为一抗，用Western blot测定重组蛋白的表达量，同时以β-actin为内参蛋白。
1.6 重组蛋白PEDV S1-NTD的免疫原性分析
什么是全球化用P2代重组杆状病毒继续感染sf9细胞，制备P3代重组杆状病毒。用MOI为0.1的P3代重组杆状病毒感染sf9细胞，第4天收取上清液即病毒液。利用30 ku的超滤管浓缩病毒以达到要
求的病毒滴度。取24只6周龄的雌性BALB/c小鼠，随机平均分为重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD组及PBS、空载体Bacmid和PEDV疫苗对照组，分别皮下注射免疫rvAcPEDV S1-NTD、PBS、空载体Bacmid、PEDV商业疫苗，其中rvAcPEDV S1-NTD免疫量为1×108 pfu/只，PBS和PEDV商业疫苗的免疫量为200 μL/只，空载体Bacmid的免疫量为1×108 pfu/只,每隔2周免疫1次，共免疫3次。
1.6.1 抗体效价 在第1次免疫后的第0(第1次免疫当天)，14，28和35天，每组随机取3只小鼠，断尾采血，分离血清，100倍稀释后，用ELISA法检测各组小鼠血清的效价，具体方法参照试剂盒说明书。
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