【实验目的】
1.学习和了解常用重组克隆筛选方法的原理；
2.掌握PCR法快速筛选重组克隆的操作方法。
【实验原理】
重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。常用的筛选方法有两类。一类是针对遗传表型改变筛选法，以 －半乳糖苷酶系统筛选法为代表。另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交（见实验十一）等方法。 1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）
使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。这些载体的共同特征是载体上
携带一段细菌的基因lacZ。lacZ编码 －半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的 肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。重组子由于外源片断的插入使 肽基因失活不能形成 互补作用，也就是说，宿主细胞表现为 －半乳糖苷酶失活。因此，在X-gal平板上，重组克隆为无噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝噬菌斑或菌落。这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小
从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定
对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交
为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern印迹转
移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
5．PCR法
三级教育用PCR对重组子进行分析，不但可以迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA 序列分析。因为对于表达型重组子，其插入片断的序列的正确性是非常关键的。PCR法既适用于筛选含特异目的基因的重组克隆，也适用于从文库中筛选含感兴趣的基因或未知的功能基因的重组克隆。前者采用特异目的基因的引物，后者采用载体上的通用引物。
6．菌落（或噬菌斑）原位杂交
菌落或噬菌斑原位杂交技术是将转化菌DNA转移到硝酸纤维膜上，用放射性同位
素或非放射性标记的特异DNA或RNA探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆。这种方法能进行大规模操作，是筛选基因文库的首选方法。
本实验采用PCR法对重组子（pT-EF1，见实验）进行筛选。使用引物为基因特异引物（见实验）。
【试剂与器材】
（一）试剂
1.LB液体培养基
2.30%（V/V）甘油：用水配制后，高压蒸汽灭菌。
3.PCR反应体系（TaKaRa公司）
（二）器材
PCR仪、水平电泳装置、电泳仪、水浴锅、恒温振荡器、台式高速离心机、微量移液器、凝胶成像系统等。
（三）菌株
大肠杆菌DH5α转化菌。CUTTING POINT
引文翻译【操作方法】
1.从转化平板上挑取单菌落，每个单菌落分别接入两支装有1mL 培养基的EP管中（一支检测用，一支保种用），强烈震荡培养过夜。
2.将保种用菌液于超净台内加入等体积30%甘油，―20℃冰箱保存。
3.将检测用菌液室温10,000r/min，离心1min，收集菌体。
4.弃上清，加入200μL 无菌ddH2O中，充分涡旋，悬浮菌体。
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5.将EP管置沸水中煮10min~15min，至出现白絮状沉淀。
6.10,000r/min，室温离心1min。
7.吸取上清作为PCR检测的样品。
8.琼脂糖电泳检测PCR结果，对照marker估计外源片段的大小，选择出含合适大小DNA 片段的克隆，保存菌种（日后提纯质粒作测序用）。
【注意事项与提示】
1.在沸水中一定要煮至出现白絮状沉淀，此时质粒释放于上清中。
在线lowe玻璃2.用煮沸法作PCR反应模板，受质粒的浓度和纯度等未知条件限制，有时需要优化PCR条件。
3.本方法既适合筛选含特异目的基因的重组克隆，也适合于从文库中筛选含感兴趣的基因或未知的功能基因的重组克隆。前者采用特异目的基因的引物，后者采用载体上的通用引物。
【实验安排】
第一天上午配试剂和培养基，下午从转化平板挑取单菌落接种；
第二天上午用煮沸法裂解细菌取上清作PCR反应。下午琼脂糖电泳检测结果并保存阳性菌种。
【实验报告要求与思考题】
1．用PCR法快速筛选重组克隆，应注意哪些操作环节？
2．提交PCR法快筛选重组克隆的电泳图，并分析结果。
附录1：
本实验流程：
从转化平板挑取单菌落接种第一天下午
过夜培养教授女儿的婚事
煮沸法裂解细菌，取上清作PCR反应第二天上午
琼脂糖电泳检测结果第二天下午
保存阳性菌种
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