第30卷第1期2021年1月
上海海洋大学学报
JOURNAL OF SHANGHAI OCEAN UNIVERSITY
Vol.30,No.l
Jan.,2021
文章编号;1674-5566(2021)01-0011-101)01:10.12024/jsou.20190502644糖原贮积症V型斑马鱼疾病模型的构建及其表型分析 黄姣心，霍锦倩23，刘姣心，祖尧心，张庆华心，李伟明“，任建峰W
(1.上海海洋大学科技部海洋久物科学国际联合研究中心，I：海201306； 2.1：海海洋大学水产种质资源发掀9利用教育部重点实验室，上海201306； 3.±海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，1：海201306； 4.密歇根州立大学渔业与野生动物系.密歇根东兰辛48824)
摘要：建立肌型糖原磷酸化酶基因pygma和pygmb突变体斑马鱼疾病模梨，对人类PYGM基因突变导 致的糖原贮积症V型(glycogen storage disease type V,GSD V)的研究具有重要意义利用CR1SPR/Cas9技术成功敲除了斑马鱼pygma和pygmb基因，分別获得pygmd-叫"和pygma"昕“两种纯合突变体，以及pygmb'■利两种纯合突变体.过碘酸希夫糖原染(periodic acid Schiff slain)实验显示pygma Tfy pygmb-纯合突变体心脏和肌肉组织出现明显的糖原累积。对野生型斑马鱼15个早期发育时间点以及12个成《1组织中pygma和pygmb基因表达分析显示.pygma和pygmb早期发育阶段表达模式相似，从24 hpf到125hpf,W基因表达量总体呈上升趋势，且pygmb的I：升幅度大于pygma的上升幅度。在检测的12个组织中,pygma和pygmb只在少数儿个组织中冇明显表达pygma在肌肉组织中表达最高，其次为心脏和皮肤组织;pyg皿在心脏、脑、眼睛3个组织中高表达，在肌肉组织中也有表达，但表达量相对较低。斑马血pygma7■和pygm/厂突变体貝有GSD V病肌肉糖原累积的典型特征，该疾病模型的建立为进•步研究糖原贮积症的发病进程、详细机制和药物筛选等策略提供基础数据: 关键词：斑吗他；肌型糖元磷酸化酶；糖原贮积症V型；的为敲除；疾病模型
中图分类号：S9I7文献标志码：A
糖原是一种高分子量多糖物质，在动物组织中作为葡萄糖的储藏库用于能量代谢，对于生命活动的维持具有重要作用⑴。糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,GP)是糖原分解过程中的限速酶，主要作用是将糖原水解成1-磷酸葡萄糖，继而转化成6-磷酸葡萄糖，再经过糖酵解过程转化为丙酮酸，在有
氧情况下，丙酮酸进入柠檬酸循环，产生大量三磷酸腺昔(adenosine triphosphate,ATP)2，为机体提供大量能量。糖原磷酸化酶是一种大分子蛋口聚合体，其活化状态时的结构为两个相同的亚单位形成的二聚体，并具备多个功能结构域，包括催化域、糖原结合域、变构域和丝氨酸残基磷酸化域。在人体，糖原磷酸化酶具有3种亚型，即肝型(liver-type glycogen phosphoiylase,PYGL)、脑型(brain-type glycogen phosphorylase,PYGB)和肌型糖原磷酸化酶(muscle-type glycogen phosphoiylase, PYGM)⑶。
糖原贮积症(glycogen storage disease,GSD)是一组遗传性糖原代谢障碍引起的疾病"，主要涉及心脏、肝脏、肌肉和脑中糖原代谢异常"。糖原贮积症有很多类型，其中I、ni、vi和ix型以肝脏病变为主，II、v和w型以肌肉组织受损为主3。GSDV型又名McArdle氏病，该病的致病原因是肌型糖兀磷酸化酶PYGM缺乏导致糖原大量累积在肌纤维内，该病的主要临床特征为运动耐受不良⑺，在严重的病例中，可伴有横纹肌溶解、肌红蛋白尿和致命的肾功能衰竭的表型*。患有McAnlle氏病的老年患者由于缺乏锻炼，也更容易受到II型糖尿病和心脏病等继发性
丁学强收稿日期：2019-05-12修回日期：2020-03-13
基金项目：上海市科学技术委员会国际科技合作项11(154107233(H))
作者简介：黄姣(1993—)，女，硕上研究生，研究方向为发育生物学E-mail=*****************
通信作者：任建峰,E-mail:jfren@shou.edu
http：//www.shhydxxb
12上海海洋大学学报30卷
病症的影响⑼。
动物疾病模型的构建对于在生理学、病理学和学方面开展疾病研究具有重要意义。目前,NOGALES-GADEA等〔心通过将携带突变位点的Pygm(R50X)敲入小鼠体内，造成小鼠体内糖原磷酸化酶遭到破坏，成功构建了McArdle氏病小鼠模型；纯合突变体小鼠活检实验显示肌肉中有大量糖原累积，行为学实验测试显示，纯合突变体小鼠运动能力很差，体内出现高尿酸血症，这些特征与人类McArdle氏病患者特征一致〔回。
斑马鱼(Danio rerio)因其具有生殖周期短、产卵量大、胚胎透明、养殖成本低等优点，已经成为现代遗传学和发育生物学研究的重要模式动物。近年来，斑马鱼也被广泛应用于人类疾病模型构建和药物筛选平台，已成为继小鼠之后的另一种重要的动物疾病模型McArdle氏病致病基因PYGM在斑马鱼中有2个同源基因，分别是pygma和pygmb，其编码的蛋白与人类PYGM 蛋白相似性高达90%以上，因此斑马鱼McArdle 氏病模型可能与小鼠疾病模型的表型相似，但又可能存在差别。利用CRISPR/Cas9
技术成功构建了斑马鱼pygma和pygmb纯合突变体，表型分析证实突变体具有糖原贮积症肌肉糖原累积的典型特征。该疾病模型的建立，为糖原贮积症的发病进程、详细机制和药物筛选等策略提供基础数据。
1材料与方法
11材料与试剂
野生型斑马鱼AB品系购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所斑马鱼平台。gRNA质粒由北京大学分子医学研究所熊敬维教授惠赠；DH5a菌株购自天根生化科技(北京)有限公司；gRNA体外转录试剂盒MAXIscript®T7in Vitro Transcription Kit(AM1314)购自Ambion公司；Cas9蛋白NLS-Cas9-NLS(Z03389-100)购自金斯瑞生物科技公司；DNA Clean&Concentrator®-5 (D4014)购自Zymo Research公司；Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix(M0531L)和T7 Endonuclease I(MO3O2L)购自NEB公司；2X EasyTaq®PCR SuperMix for PAGE(AS112)购自北京全式金生物技术有限公司;TRIzol(15596-018)购自Invitrogen公司；反转录试剂盒PrimeScript1'1RT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047A)购自TaKaRa公司；LightCycler®480 SYBR Green I Master(Roche,***********)和LightCycler®480U(Roche)实时荧光定量PC R 系统均购自罗氏公司；糖原PAS染液试剂盒(G1281)购自北京索莱宝生物科技有限公司。
1.2方法
1.2.1基因敲除靶点设计及gRNA合成
从Ensembl数据库(http：//sembl. org/index.html)获得斑马鱼pygma和pygmb基因组序列。pygma基因包含20个外显子,pygmb基因包含21个外显子。靶点位置选择尽量位于靠近起始密码子的外显子序列，通过zifit网站(http：///ZiFiT/)查靶点，靶点序列通过NCBI网站与斑马鱼基因组序列进行BLAST(https；//blast,ncbi.v/Blast. cgi)比对，确定靶点的特异性。 利用T7启动子合成靶点gRNA。分别利用pygma上游引物：TAATACGACTCACTATA GGACT GGCTGCCTACGGITA GTTTTAGAGCTAGAAATAGC, pygmb上游引物：TAATACGACTCACTATA GGTCG CGGACGGTGTGCGCC GTTTTAGAGCTAGAAATAG C(下划线碱基为靶点序列)和下游通用引物：5，-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3f扩增gRNA 质粒，然后利用PCR产物作为模板，体外转录合成gRNA。
1.2.2显微注射制备基因敲除F o嵌合体
首先，进行亲本纯合子筛选。选取生长良好的性成熟野生型AB品系斑马鱼雌雄各10尾，剪取尾鳍碱裂解法提取基因组DNA，利用靶点上下游引物(表1)扩增获得PCR产物，并送至生工生物有限公司进行测序。如果所有个体PCR产物序列一致，则认为该亲本为纯合子，其胚胎可以用于显微注射。
其次，对受精卵进行显微注射并检测基因敲除效率。注射液Cas9蛋白质量浓度为800ng/ pL,gRNA质量浓度为100ng/^L，注射剂量为1 nL o将已注射和阴性对照胚胎置于28.5T培养箱中进行孵化，并定期换水。取注射后2dpf (days post fertilization)的胚胎(5枚胚胎/管,3管)进行敲除效率检测。向每管样品中加入50 (1L50mmol/L NaOH,95七加热10min，涡旋振荡；重复加热振荡；加入5“L pH8.0,1mol/L
http：//www.shhydxxb
1期黄姣，等：糖原贮积症V型斑马鱼疾病模型的构建及其表型分析13
Tris-HCl,10000r/min，离心5min，上清即为基因组。根据表1所列引物进行PCR扩增。PCR反应体系包括2.0jl L DNA模板，1.0pL上游引物, 1.0r L下游引物，8.5ijl L ddH2O,12.5jxL2x EasyTaq®PCR SuperMix for PAGE O PCR反应程序：94r3min；94°C30s,60X.30s,72七40s，共33个循环;72°C5min o
利用T7E1酶切法和测序法进行基因敲除效率检测。将PCR产物进行T7E1酶切检测，计算基因编辑效率，具体公式如下：
1-b+c\x100(1)
a+b+c)
式中:E为基因编辑效率,％；a为未切开电泳条带的灰度值』和c分别为切开电泳条带的灰度值。
将酶切成功的PCR产物测序，若敲除成功，靶点附近及其以后出现套峰。将敲除成功的F。嵌合体胚胎饲养至性成熟。
表1靶点及检测引物序列信息
Tab・1Inforaiation of target sites and detecting primer sequences
基因靶点(5'3)引物序列长度Gene Target Site(5'-3')Primers Length/bp
pygrrui GGACTGGCTGCCTACGGTTA F：CTTTAGAACTTTCCACAGGCAT
R:TGCTACAGTATCAATGGTAATG
394
pygrnb GGTCGCGGACGGTGTGCGCC F：TGACGGACCAAGAGAAGAGGA
R:GCAGTCTTCCGAACCACAAGT
444
1.2.3纯合突变体的筛选及表型分析
将性成熟的F o嵌合体与显微注射时留作对照的野生型成鱼外交获得片，然后进行基因突变类型的筛选，片包含多种突变类型。待F，长大后，剪取尾鳍提取基因组，进行PCR扩增和产物T7E1酶切。酶切成功的PCR产物纯化后进行TA克隆，每尾F，挑选5个单克隆进行测序，确定基因突变类型。
将相同突变类型的叫杂合子成鱼分别内交，获得不同突变类型的F2O对F2成鱼剪尾鳍提取基因组，同基因编辑效率检测方法，进行PCR扩增和产物T7E1酶切检测。PCR产物切开对应的个体为杂合子；PCR产物未切开对应的个体为WT或突变体纯合子，通过PCR产物测序及序列比对，确定F2为WT或纯合突变体。F2纯合突变体可以继续内交获得F3，观察表型。
1-2.4pygma和pygmb纯合突变体糖原累积情况检测
通过PAS染法(periodic acid Schiff stain)检测糖原在组织中的累积情况。分别收集野生型、pygma"和pygm/f"成鱼的心脏和肌肉组织，用体积分数为10%的甲醛固定液固定24h后进行常规石蜡切片。PAS染步骤按照试剂盒使用说明操作。染封片后，在光学显微镜下观察并拍照。1.2.5pygma和pygmb在不同发育时期和成鱼不同组织的表达
对pygma和pygmb基因在早期不同发育时期和成鱼不同组织的表达水平进行检测。选取斑马鱼15个早
期发育时间点[1细胞期(1-cell),4细胞期(4-cell),16细胞期(16-cell),1k细胞期(1k-cell)，球形期(sphere stage)，胚盾期(shield stage)，尾芽期(bud stage),12hpf(hours post-fertilization, hpf),24hpf,36hpf,48hpf,60hpf,72hpf,100 hpf和125hpf]，每个时期的胚胎取3组生物学重复。选取野生斑马鱼成鱼的12个组织，分别为心脏(heart)、肌肉(muscle)、皮肤(skin)、脾脏(slpeen)、脑(brain)、鲍(gill)、肠(intestine)、肾脏(kidney)、卵巢(ovary)、精巢(testis)、眼睛(eye)和肝脏(liver)，每个组织取3个生物学重复。所有样品采用TRIzol法提取总RNA。
使用PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行总RNA反转录，获得cDNA；使用NCBI在线程序(https：//bi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/)设计pygma和pygmb qRT-PCR引物(表2)，使用罗氏SYBR/Green和LightCycler®480H实时荧光定量PCR系统进行荧光定量检测。以斑马鱼/3-actin基因作为内参对照，使用2"g法计算基因相对表达量使用软件Graphpad prism5绘制柱状图。
http：//www.
shhydxxb
14上海海洋大学学报30卷
2结果
2.1pygma和pygmb基因序列分析及敲除靶点
设计
在pygma基因的第4个外显子上设计1个正
向靶点（图la），在pygmb基因的第1个外显子上
设计1个反向靶点（图1b），并将斑马鱼pygma和
pygmb基因编码蛋白序列与小鼠pygm以及人类
PYGM基因编码蛋白序列进行相似性分析。结果
显示,PYGM蛋白在人类、小鼠和斑马鱼中高度保
守（图lc），斑马鱼Pygma与小鼠和人类PYGM
爱国家不等于爱朝廷
蛋白的序列相似性都是93%，斑马鱼Pygmb与小
鼠和人类PYGM蛋白相似性都是92%。
表2qRT-PCR引物序列
Tab.2Primer sequences for qRT-PCR
基因引物长度
Gene Primer l^ength/bp
PJgrrui F ATGCTGATGCACCACGACAG
179 R TCACGGGCATACTGGGAGAT
Pygmb F GATTAACAGACGTCATATGG
137 R CATGTGAGCCAACGATGCAG
B_actin F:ATGGATGAGGAAATCGCTG
140 R ATGCCAACCATCACTCCCTG
2.2F。嵌合体制备及基因敲除效率检测
对显微注射的5枚混合胚胎F o嵌合体基因敲除效率进行了T7E1酶切检测。根据酶切片段条带的灰度值，利用公式计算得出pygma基因3组平行实验的敲除效率分别为42.9%,51.4%和54.3%（图2a）；pygmb基因3组平行实验的敲除效率分别为11-3%,5.5%和15.5%（图2b）。将酶切成功对应的PCR产物进行测序，发现在靶点附近及其后出现套峰现象，表明基因编辑成功（图2c,d）。专才与通才
2.3基因敲除纯合突变体F2的筛选
突变可遗传的F o嵌合体与野生型外交获得的后代叫生长至合适大小，通过T7E1酶切检测方法筛选杂合子片。在52尾pygma Fj中筛选到31尾杂合子（图3a），在54尾pygmb F，中筛选到22尾杂合子（图3b）。F，杂合子基因组PCR产物通过TA克隆测序检测,pygma筛选出2种有效突变类型（图3c）,pygmb也筛选出2种有效突变类型（图3d）。
分别将pygma两种突变类型（-11bp和+14bp）和pygmb两种突变类型（+1bp和
-2bp）F，内交获得F2。待F2长至2个月大小，对其剪尾进行基因型鉴定，并对F?个体基因型和数目进行统计分析，具体基因型及其数目见表3。
pygma和pygmb基因最长转录本编码的氨基酸数目为842。pygma-的两种突变类型：-11bp 和+14bp分别编码的氨基酸长度为151和218。pygmb"的两种突变类型：+1bp和-2bp分别编码的氨基酸长度为126和125。
表3pygma和pygmb不同基因型F：个体数目统计Tab.3Statistics on the number of different
genotypes of pygma and pygmb F2
基因基因型野生型杂合子纯合子
Gene Genotype Wild Type Heterozygote Homozygote
-11bp142515 pygnui
+14bp8199
+1bp124726 Pygmb
—2bp16119
2.4纯合子F2及其后代F3表型分析
与野生型相比,pygma和pygmb两种突变类型的F2纯合子在生长发育过程中未发现异常表型。pygma7^]pygmb F2自交后代F，发育正常无异样。
利用PAS糖原染法对野生型、pygma"和pygmb7-斑马鱼心脏和肌肉组织中糖原含量进行检测，结果显示：与野生型相比较，pygma'和pygmb"的心脏和肌肉组织中岀现明显的糖原累积（图版）。
2.5pygma和pygmb早期发育时期表达谱和成鱼组织表达谱
对野生型斑马鱼15个早期发育时期和成鱼12个组织pygma和pygmb基因表达进行定量分析。早期发育时期基因表达分析结果显示：pygma和pygmb斑马鱼早期发育阶段表达模式相似,pygma在24hpf前几乎不表达,pygmb表达稍早一些，在胚盾期（shield stage）开始表达；从24 hpf到125hpf，两基因表达量总体呈上升趋势（图4a,b）,JI pygmb的上升幅度大于pygma的上升幅度,pygmb的表达量高于pygma。
斑马鱼成鱼组织基因表达分析结果显示，在检测的12个组织中,pygma和pygmb只在少数几个组织中有明显表达。pygma在斑马鱼肌肉组织中表达最高，其次为心脏和皮肤组织，在眼睛中也有表达（图4c）；pygmb在心脏、脑、眼睛这3个组
http：//www.shhydxxb
1期黄 姣，等：糖原贮积症V 型斑马伯疾病模熨的构建及其表型分析
15
•xon1 ・xon2 «xon3 exon* ・xon7 ・xon14 axon17 «xon19
ogactooctocctacgottxbiq
(a)
•xon1 axonl ・xon3 exon*
应激反应[SCI^GCOCACACCOTCCQCaACC
e M l S i
•son17
J-UTR
360360360360
Human -PYGM Mouse-PYGM
Zebraflah-Pygma Zabrafiah-Pygmb Human-PYOM Moua*-PYGM
Zebrati ・h-Pygma Zebrafish-Pygmb F
420
420
420
420
Zabraflah-
Mouse-PYQM
Human-PYOM 480480480480李人志
Human-PYGM Moua«-PY (n (
Zabraf iah-Pygin« Zabrafiah-Pygmb
9 dfclWJS 5
540540540540
K umd -PYOM AX 142 Mouse-PYON KX
Zabraflah-Pygna XK 842Zabraflah-Pygmb 8R 842
能效监测终端
(c)
(a) pygma 基因结构及其敲除靶点的序列和位置；Wpygmb 基因结构及其敲除靶点的序列和位置；(c)人类、小鼠和斑马鱼之间 PYGM 蛋白序列相似性比对。红方框表示Cas 蛋白识别的PAM( protospacer adjacent motif)区。
(a ) The gene structure of pygma and the sequence and location of the target site ; ( b) The gene structure of pygmb and the sequence and location of the target site ； ( c ) The alignment of amino acid sequences of PYGM between human , mouse , and zebrafish. The red box indicates
the Cas9 protein recognized PAM region.
图1斑马鱼pygma 和"怡加方基因敲除靶点示意图及编码蛋白序列相似性分析
Fig. 1 Schematic diagram of target sites of pygma and pygmb and the sequence alignment of PYGM between human , mouse and zebrafish
http ： //www. shhydxxb.
com
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议