网络出版时间：2020-19-99：11网络出版地址：https：//CqskS cePkcms/dxPU34.145.R.202012021526.410.htmi
彭芳，胡擎鹏
摘要目的研究葛根素对匹罗卡品诱导癫痫大鼠海马神经元的保护作用及其可能机制。方法随机将34只成年雄性Wcmz大鼠均分为5组：对照组、匹罗卡品组、溶剂组、50 mg/Cg葛根素组、25mg/Cg葛根素组。采用NisW染观察海马CA3区锥体神经元变化；TUNEL法观察葛根素对癫痫诱导的神经元凋亡的影响；检测线粒体膜电位及ROS变化; Wester/blot检测Bux、Bcl-2、Mih-CytC、CyP-CytC、Ci-caspaseC表达。结果Ncsi染发现葛根素能减轻癫痫诱发的神经元死亡(P<0.25);TUNEL法观察结果，葛根素组癫痫诱导的神经元凋亡数较匹罗卡品组降低(P<0.05)；与匹罗卡品组相比,25、50mg/Cg葛根素组线粒体膜电位上升(P<0.05)；与对照组相比，匹罗卡品组线粒体ROS水平在3h后开始增加，并在72h达到最大水平(P<0.201)，而经葛根素预处理后线粒体ROS水平下降(P<0.05)；与对照组比较，溶剂组或匹罗卡品组BU'CyP-CytC'CPcaspaseC表达升高，而Bcy2、MitxCytC表达降低，葛根素干预后Bci-2、Mih-CytC表达升高，Bux、CyP-Pyt/、Cp3asnase3表达降低。结论葛根素对匹罗卡品致癫痫大鼠海马神经元损伤具有保护作用，其机制可能与抑制Bcx诱导的线粒体CytC释放而减少细胞凋亡有关。 关键词葛根素；匹罗卡品；癫痫；海马神经元；线粒体
中图分类号R741
文献标志码A文章编号600-692(2020)6-1888-05 doRlO.19405/p cnki.issclOOO-1496.2022.12.410
许多研究J］表明，氧化应激参与了癫痫的病理生理过程，其中活性氧(reactive oxypen species；ROS)水平的升高是癫痫诱发神经元损伤的主要原因。最近研究［］表明，线粒体通透性转变孔(mho-chonkUS peuneaPiCto transition poms,MPTP)开放后线粒体膜电位发生改变，促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白和细胞素C(CyP)等蛋白释放进入细胞质，并启动caspase级联反应，最终导致神经元凋亡，提示线粒体可能在癫痫损伤中起重要作用；葛根素是从草药
2029-07-29接收
基金项目：湖南省教育厅优秀青年项目(编号:6B235)
作者单位：南华大学附属第二医院儿科，衡阳42601
作者简介：彭芳，女，主治医师，本科；
胡擎鹏，男，博士，副主任医师，责任作者，E-mUi:peog-
nevg007923@65. com 葛根中提取的一种黄酮类化合物，具有抗感染、抗氧化、抗凋亡等多种药理作用［］。据研究⑷报道，葛根素对体外缺氧缺糖细胞和体内缺血性脑损伤具有神经保护作用。然而，葛根素对癫痫大鼠海马神经元损伤的影响尚不清楚，该研究旨在探讨葛根素能否减轻匹罗卡品诱发癫痫发作后海马神经元的凋亡以及可能的作用机制。
1材料与方法
1-1材料匹罗卡品购自美国Sigma公司；ROS测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；罗丹明63购自美国Sigma公司；细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；组织线粒体分离试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；Bax (1：500)、Bci-2(1:54、、Mic-CytC(1:140)、Cyto-CytC(1:104)、Ci-caspaseC(1:54)抗体购自英国Abeam公司。
1.2动物及模型建立34只成年雄性WRtaz大鼠，体质量254-340g，购自南华大学实验动物中心［SCXK(湘)2716-423］。所有大鼠均饲养在室温下并自由获取水和食物。实验经南华大学动物实验伦理委员会批准(编号：206-65)。
给予Wistaz大鼠腹腔注射氯化锂(127 ma/Cg),15~24h后腹腔注射硫酸阿托品(1 mg/kg),30min后腹腔注射匹罗卡品(34mg/kg)致癫痫。参考Rxcine规定标准,4~5级癫痫发作，被纳入实验组。癫痫持续66min，然后注射(6 mg/kg，静脉注射)以降低死亡率。对照组大鼠接受相同体积的0.9%生理盐水。
大鼠在癫痫发作消失后第2、8、24、72h被处死。
1.2动物分组将大鼠随机均分为5组:①对照组;②匹罗卡品组;③溶剂组：匹罗卡品给药前6 min给予溶剂(
2.5mi生理盐水)；④54mg/kg葛根素组;⑤25mg/kg葛根素组。葛根素溶于生理盐水中，浓度为5mg/mi，腹腔注射。
1.4海马CA3区锥体神经元Nissl染凶72 h后，将大鼠麻醉处死，取出脑组织置于4%多聚甲 醛中，石蜡包埋，切片，脱蜡至水，采用甲苯胺蓝
NCs t染法，对大鼠海马CA3区锥体细胞(0.5mm 长)进行盲法计数。
1.3海马CA3锥体神经元TUNEL染⑷参照试剂盒说明书，进行TUNEL染测定凋亡神经元数量。在高倍显微镜下计数双侧大脑半球海马CA3锥体细胞数(0.5mm长)o
1.0线粒体分离分离海马组织，迅速放入预冷分离介质，彻底清洗组织，用玻璃匀浆器制成匀浆液, 652r/min离心6min沉淀细胞核及细胞碎片，收集上清液，以6000r/min离心6min，沉淀的线粒体用3%Ficoli溶解后铺于6%Ficali界面上，并在6500X y离心12min，将最终的线粒体颗粒悬浮在分离培养基中并在-80七下保存。所有步骤在0〜4°C下预冷离心机中进行，蛋白质浓度由双辛酸(biciqcUoninic
acid,BCA)分析。
1.0线粒体膜电位测定将线粒体蛋白悬浮液(12 MU)加入
2.5mi反应缓冲液中，再加入4以Rh-123使其终浓度为26p mh/L,37C下孵育5min，然后12C下6000X g离心6min，在543nm激发波长和527nm发射波长下测定上清液荧光强度。
14线粒体中ROS水平检测线粒体(0.4 mg/mi)与荧光探针2,,7,-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2',7'-DChmrodihydroXuorescein diacetata:DCFH-DA)(2pnoUL)在27C孵育34min，在457nm激发波长和534nm发射波长条件下测量DCF荧光，具体操作按照试剂盒说明书进行。ROS水平以荧光强度单位表示。
1.3Western blot检测Bao s Bel-2s Mite-CytC s Cy-ta-CytC、Cl-caspase3表达取海马组织54mg，加入裂解液,BCA法测定总蛋白浓度，将等量蛋白(34p g、上样，通过SDS-FAGE凝胶电泳，然后转移到硝化纤维素膜上,5%脱脂牛奶中封闭2-加入一抗4C孵育过夜，洗涤后，二抗孵育2-ECL显、曝光、洗片，采用Imago Lab4.4软件测定各条带灰度值，以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白相对表达量。
1.11统计学处理所有统计分析均采用SPSS 17.4软件进行分析，数据用x±$表示，结果用单因素方差分析和g检验进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1海马神经元形态学观察对照组CA3区锥体神经元正常呈圆形，而匹罗卡品组神经元凋亡呈核固缩状。匹罗卡品组存活神经元数量较对照组降低(P <0.41,F=1.787)o25、54mg/kg葛根素组能减轻癫痫诱发的神经元凋亡(P<0.07)，见图2
24TUNEL法观察葛根素对癫痫诱导的神经元凋亡的影响对照组脑切片中未检测到TUNEL阳性细胞，匹罗卡品组和溶剂组切片中观察到大量TUNEL阳性细胞。与匹罗卡品组相比，25、54 mg/kg葛根素组癫痫诱导的神经元凋亡数下降(P< 0.05,F=2.457)，见图2。
2.2葛根素对癫痫发作后线粒体膜电位的影响
与对照组相比,2h时匹罗卡品组线粒体膜电位无明显差异(P>0.05,F=3.16)，而癫痫发作后5h 线粒体膜电位下降，并持续下降至72h(P<0.07, F=2.454)；与匹罗卡品组或溶剂组相比,27,54 mg/kg葛根素组线粒体膜电位上升(P<0.47,F= 1.490)，见图3o
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图1Niss l染观察海马CA3区锥体神经元X290 A：对照组;B：匹罗卡品组；C：溶剂组；D：57mg/kg葛根素组; E：25mg/kg葛根素组；与对照组比较:**P<0.01；与溶剂组比较: #P<0.07,##P<0.
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图2TUNEL染观察海马CA8区锥体神经元凋亡X202
A：对照组;B：匹罗卡品组；C：溶剂组；D：52mg/i葛根素组；
E：25made葛根素组；与对照组比较：***P<7.071；与溶剂组比
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图8葛根素对癫痫大鼠线粒体膜电位影响
A：对照组与匹罗卡品组线粒体膜电位比较；B：癫痫发作后9 k各组线粒体膜电位比较;/：对照组；4
匹罗卡品组；/溶剂组；d：52mg/da葛根素组；c：25mg/da葛根素组；与对照组比较，*P< 7.75,**P<7.21,***P<7.271；与溶剂组或匹罗卡品组比较：#P <7.75,##P<7.21
2.4葛根素对癫痫大鼠线粒体ROS产生的影响
与对照组相比，匹罗卡品组线粒体ROS水平在癫痫发作后8h开始增加，并在72h达到最大水平(P< 2.021/=3.585)而与溶剂组或匹罗卡品组相比,25、52my/dy葛根素组线粒体ROS水平下降(P <2.25,F=2.335)，见图4。
图4葛根素对癫痫大鼠线粒体ROS生成影响A：对照组与匹罗卡品组线粒体ROS比较；B：癫痫发作后9h 各组线粒体ROS比较；：对照组；4匹罗卡品组；/溶剂组；d：57 made葛根素组；c：25mg/da葛根素组；与对照组比较：*P< 7.75,**P<7.21,***P<7.071；与溶剂组或匹罗卡品组比较：#P
<7.75,##P<7.71
2.4葛根素对Bax x BcH x Mitr-CytC x Cytr-CytC x Cl-caspase3表达的影响与对照组比较，溶剂组或匹罗卡品组Bax、Cy/-CytC、C--caspase3表达升高，而BiV、Mim-CytC表达降低；而与溶剂组或匹罗卡品组相比，25、52my/dy葛根素组BciV、MUo-CytC 表达升高,Bax、Cym-CytC、C--caspase3表达降低，
见
图5。
□对照组
图5Bao、BdP、Mao-CytC、Cyto-CytC、CipespaseX蛋白表达
2对照组；2：匹罗卡品组；5：溶剂组：4：57my/g葛根素组；5：25my/g葛根素组；与对照组比较:**P<0.02***P<0.001；与溶剂组或匹罗卡品组比较:#P<0.075#P<O01
3讨论
癫痫是一种阵发性脑功能障碍疾病，持续性发作可导致脑神经元变性，虽然在癫痫发作后致神经元损伤方面的研究已取得很大进展，但其机制仍不清楚，且防治损伤发生发展的方法有限。本研究显示葛根素对癫痫引起的神经元损伤具有保护作用。线粒体功能障碍被认为是癫痫的一个重要促发因素［］，鉴于线粒体在诱导细胞凋亡中的重要作用，假设靶向线粒体信号通路的药物可能具有广泛的神经保护作用。
越来越多的研究表明［］，氧化应激作为一个关键因素不仅是癫痫发作的后果，而且可能参与了癫痫
发生。在癫痫患者大脑中，过量ROS产生会导致细胞损伤和死亡。线粒体除了合成ATP夕卜，还具有多种极为重要的功能，是细胞内生成ROS的主要部位，也是ROS诱发氧化损伤的主要靶点［］。线粒体功能失调会产生更多ROS，同时ROS介导的线粒体氧化损伤也会导致更多ROS产生［14］o癫痫发作产生大量ROS，随后ROS引发的氧化损伤会导致MPTP开启，这使线粒体释放诸如CytC及凋亡诱导因子等成分依次启动凋亡［2］，因此使用抗氧化剂调
节线粒体功能可能是癫痫的潜在方法。NCs t 染显示,4722mg/kg葛根素组能减轻癫痫诱发的神经元凋亡（P<0.47），这说明葛根素对癫痫诱发神经元死亡具有保护作用；葛根素对线粒体膜电位及ROS影响：经2722mg/kg葛根素后，线粒体产生的ROS明显减少，而膜电位增加，这可能是葛根素抗氧化作用的结果,ROS减少可能会调节线粒体功能从而减少细胞凋亡；在本研究中，葛根素预处理能显著减少癫痫发作后大鼠海马神经元TUNEL阳性细胞的数量，这提示葛根素通过保护线粒体功能发挥抗凋亡作用，可能与其抗氧化作用具有潜在关系。
Bci-2家族蛋白在细胞凋亡过程中起着重要作用，如Bax和Bci-2是调节细胞凋亡和CytC的关键分子［6］o Bci-2能促进细胞存活并抑制各种刺激引起细胞凋亡，其过表达能减少线粒体释放Cyt/［15］o 而Bax是一种促凋亡因子，它可以插入线粒体外膜从而开启MPTP，释放CytC，而CytC释放会最终激活caspasa-3：导致DNA断裂、核染质浓缩和凋亡［6］o Western blot结果显示，匹罗卡品组大鼠Mi-m-Cyt/表达较对照组明显下降，这可能是由于匹罗卡品能上调Bax表达、抑制Bci-2表达，而27,54
mg/kg葛根素预处理后上调Bci-2表达、下调Bax表达，从而抑制Cyto-CytC以及caspasa-3的激活。
ROS诱导的DNA损伤可导致细胞周期停滞甚至凋亡。还有研究［15］表明，ROS参与了癫痫介导神经元变性过程中凋亡机制的触发。因此，ROS可能参与了一些癫痫模型中细胞凋亡相关蛋白的调节。Western blot结果显示，葛根素组Bci-2、Mho-CytC表达升高,Bax、Cyto-CytC、Ci-caspaseC表达降低，这可能是葛根素抗氧化作用的结果，葛根素能有效地减少癫痫大鼠海马线粒体ROS的生成，恢复线粒体功能，进而通过抑制Bax诱导的线粒体CytC释放而减少细胞凋亡。
综上所述，本研究首次证明葛根素对癫痫大鼠海马损伤的作用，尽管其可能机制和长期使用效果仍需确定，但葛根素是一种很好的抗氧化剂，它通过保护线粒体功能从而对癫痫损伤起到神经保护作用，具有潜在的价值。
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neurons in epileptic rats induced by pilocarnine
Peng Fug/Hu Qin/eng
休谟问题(Dept of Pediatrics,TU c Secooi filiated Hospital of Nannua口皿询^,‘HerLCTig421001)
Abstract Objective Tv stuPy tha y/tectiva effect of Puerakn on hippocampal nen/ns of epiUptic rats induced Up piUcarpino an/U s possib-a mechanism.Methods34aPuit mala Wist/r rats were mn/omiy dUibed into5 gmups：contml y/up,piUcarnine y/up,solvant g/up,52my/dy puerakn g/up,25my/dy puerakn gmup,6 rats in each g/np.The changes of pyrami/ai nen/ns in CA3area of hippocampus were oPsemed Up Nisst staining. The ePect of Puerakn on nen/n/optosis induced Up pi/psy was oPse/ed Up Tuneh Mi/chon/k/membrane potential an/ROS were measured.The expression of Bax,Bct-2,mitovyt/cytv-cytc//Cl-caspase3was detected Up Western bUt.Results Niss t staining showed thpt puerakn coni/reduce nen/n death induced Up pi/psy(P <2.05).The numUer of nen/n/op/sis in/uced Up pi/psy in puerakn gmup was Uwer thpu thpt in piUcarnine gmup(P<2.05).Compared with the pi/capiiia g/np,the mitocUopUka-membrane potential of Puerakn g/np increased(P<2.05).Compared with the cont/1g/np,the ROS Uveis of mi/cUopUkg in pi/cap>ine g/np Up/n /increase after8h an/reached the maximum Uvat at P2h(P<2.05).Compared with the cont/1g/np,the p-pmss/n of B/y,Cyto-CytC,Ci-caspaseC was increased in the solvent g/np or pi/cyrkiue g/np,while the expression of Bct-2an/MUo-CytC was decreased.After puerakn inte/ention ,the expression of Bct-2//MUo-CytC was increased,while the expression of B/y,Cyto-CytC an/Ci-casp
aseC was decreased.Cooclusioo Puerakn has/ p/tectiva PPt on hippocamph nen/n inju/in/uced by pi/cydiue in epi/ptic rats.Its mechanism may be related/the inkibiUon of B/y in/uced mi/chondk/CytC m/ue//the reduction of/optosis.
Key worbs Puerakn；piUcadine;piUpsy;hippocamph nen/ns,mimchondka
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