作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(3): 399-406
/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
E-mail: xbzw@chinajournal
本研究由国家自然科学基金项目(31160284)和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-05)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31160284) and the Special Program of Modern Agro-industry Technology System (CARS-05).
*
通讯作者(Corresponding author): 吴昆仑, E-mail: wklqaaf@163, Tel: 139********
第一作者: E-mail: yaoxiaohua009@126, Tel: 150********
Received(收稿日期): 2015-05-29; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(网络出版日期): 2015-12-18. URL: wwwki/kcms/detail/11.1809.S.20151218.0915.014.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00399
好来坞姚晓华 吴昆仑*
1
青海省农林科学院 / 青海省青稞遗传育种重点实验室 / 青海省高原作物种质资源创新与利用国家重点实验室培育基地, 青海西宁 810016
摘 要: 为了解脂质转运蛋白基因在青稞中的功能, 以青稞品种昆仑12为材料, 利用同源克隆得到青稞blt4.9基因序列(GenBank 登录号为KU170187), 该基因的cDNA 序列全长720 bp, 开放阅读框长348 bp, 编码115个氨基酸残基, 相对分子质量为11.2 kD, 理论等电点9.04, 不稳定系数为28.41, 是一个稳定的蛋白质。blt4.9编码的蛋白绝大多数属于疏水区, 没有较大的亲水区。序列比对显示, 该基因与大麦blt4.9基因编码蛋白的同源性最高(98.3%)。Real-time PCR 分析结果显示, blt4.9基因在20%~30% PEG-6000、4℃以及50 μmol L -1 ABA 处理后表达量显著增加, 且在抗逆性强的青稞品种(旱地紫)中的表达量高于在抗逆性弱的品种()中, 推测该基因与青稞的抗逆性有关。该研究结果为利用青稞脂质转运蛋白基因改良青稞抗逆性奠定了基础。 关键词: 青稞; blt4.9基因; 克隆; 非生物胁迫; 基因表达量
Isolation of blt4.9 Gene Encoding LTP Protein in Hulless Barley and Its Re-sponse to Abiotic Stresses
YAO Xiao-Hua and WU Kun-Lun *
Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Qinghai Provincial Key Laboratory of Hulless Barley Genetics and Breeding / State Key Laboratory Breeding Base for Innovation and Utilization of Plateau Crop Germplasm, Xining 810016, China
Abstract: Higher plant lipid transfer protein (LTP) is a class of small molecular weight alkaline single protein that can transfer phospholipids between biomembrane and form the biomembrane in cells. The objective of this study was to understand the func-tion of LTP gene in hulless barley (Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.). The cDNA sequence of the LTP gene, blt4.9 (Gen-Bank accession number KU170187), was cloned from hulless barley variety Kunlun 12. The full length of blt4.9 cDNA is 720 bp including 348 bp of open reading frame and encodes 115 amino acids. The encoding product is a stable protein with a molecular weight of 11.2 kD, theoretical pI of 9.04, and instability coefficient of 28.41. This protein is rich in Gly, Ala, Leu, and Val amino acids excluding Trp, Glu, and Phe and similar to proteins encoded by other LTP genes. Sequence alignment indicated high simila-r
ity (98.3%) of protein encoded by blt4.9 from hulless barley and barley (Hordeum vulgare L.). The Real-time PCR assay showed that blt4.9 was up-regulated by 20–30% PEG-6000, 4ºC and 50 μmol L -1 ABA and the expression level was higher in the most tolerant variety Handizi than in the most susceptible variety Dama, indicating a possible relationship between stress tolerance and blt4.9 in hulless barley. These results provide basic information in the utilization of LTP genes to improve hulless barley tolerance to abiotic stresses.领航中国文艺晚会
Keywords: Hulless barley; blt4.9; Isolation of gene; Abiotic stresses; Gene expression level
青稞(Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.)为禾本科大麦属, 因其成熟时籽粒内外稃与颖果分离, 籽粒裸露, 故称裸大麦[1]。青稞在青藏高原地区利用
价值以及独特的营养结构和保健作用使其成为极具开发利用价值的高原特农作物之一[2]。青稞主要种植于我国西北、西南地区, 特别是西藏、青海、
400作物学报第42卷
甘肃南部、四川甘孜和阿坝州、云南迪庆州等高原地区, 种植区域高寒缺氧, 环境恶劣, 降雨量少, 蒸发量大。青稞在如此恶劣的条件下表现出很强的适应性, 说明其基因组中蕴藏了丰富的与抗逆相关的优
良基因。开发利用这些优良基因, 不仅对选育青稞抗逆新品种具有重要理论意义, 而且对作物抗胁迫基础研究具有促进作用。
高等植物脂质转运蛋白(lipid-transfer protein, LTP)是一类小分子量碱性单体蛋白质, 主要参与生物膜、角质和脂类的形成, 在离体条件下参与磷脂、脂肪酸、糖脂等在生物膜之间的运输, 在植物生殖发育和信号转导等生物途径中发挥重要作用[3-5]。研究表明, LTP基因易受温度、盐、干旱胁迫、外源ABA、以及损伤等逆境诱导而过量表达, 是植物抵抗逆境胁迫的蛋白[6-8]。Hincha Dirk[9]研究表明, 当植物遭遇低温胁迫时, LTP可以充当调控蛋白, 稳定质膜活性, 抵抗低温伤害。
在大麦中blt (low-temperature responsive barley gene)基因家族是一类低温反应基因[10], 主要包括blt4 (blt4.2、blt4.6和blt4.9)、blt14 (blt14.1和blt14.2)、blt63、blt101 (blt101.2)、blt410和blt80等, 受低温诱导表达[11], 个别基因(如blt4)也同时受干旱和ABA的诱导。研究表明, blt4基因编码的是一种脂质转运蛋白, 可以通过改变质膜的组成来提高膜的冷稳定性, 对调控植物抗寒性具重要作用[12]。本文利用同源克隆技术, 获得了青稞blt4.9基因序列, 通过序列分析和功能验证, 初步认为该基因与非生物胁迫有密切关系, 可为研究青稞blt基因家族奠定基础, 为青稞抗逆基因的深入研究和抗逆育种提供候选基因。
1 材料与方法
1.1 供试材料
选用3个青稞品种, 其中来自青海省的昆仑12用于基因克隆和基因功能验证, 该品种由北青1号(母本)和昆仑1号(父本)通过有性杂交选育而成, 中抗条纹病和散黑穗病, 较抗倒伏, 抗落粒性强, 具较强的耐旱、耐寒性; 来自四川省的旱地紫具有较强的抗旱性和耐冷性, 来自甘肃省的, 其抗旱和耐冷性较弱, 这两个品种用于基因功能验证。2013年春, 将3个品种同时种植于青海省农林科学院试验田(青海西宁), 2013年秋收获种子进行室内试验。1.2目的基因克隆及基因分析
1.2.1 引物设计根据GenBank (bi. v/nuccore/U63993.1)公布的大麦blt4.9基因序列设计引物P1 (F: 5′-CGGGATCCCGAACCCA ATGGACGCAATAC-3′; R: 5′-CGAGCTCGACTCAT AGGTCCCCTCAAAG-3′), 由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.2.2 blt4.9基因的克隆与测序将青稞种子置于铺3层湿润滤纸的培养皿中, 在人工气候箱中培养, 温度为(25±1)℃, 光照强度为433 μmol m–2s–1, 每天光照14 h, 其间每天向滤纸加数滴蒸馏水, 浸透滤纸并稍有剩余, 以避免干旱。待幼苗长至约10 cm高时(约2周), 以4℃低温处理12 h, 取其叶片提取植物总RNA, 经PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)试剂盒反转录后用于目标基因的扩增模板。PCR体系为20 μL, 包括10× buffer 2.0 μL, 25 mmol L–1 Mg2+ 1.5 μL, cDNA模板1 μg, 10 mmol L–1 dNTP 0.5 μL, Taq DNA聚合酶1 U, 10 μmol L–1上、下游P1引物各0.5 μL。反应参数为94℃5 min;地质剖面图
94℃1 min, 56℃ 1 min, 72℃ 1 min 40 s, 35个循环; 72℃延伸8 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测, 并回收、纯化目的片段, 与pMD20-T载体连接, 连接体系含pMD20-T Vector 1 μL, Insert DNA 0.1~0.3 pmol, 加ddH2O至5 μL; 再加5 μL (等量)的Solution I; 16℃反应30 min。将连接好的重组DNA全量(10 μL)加至100 μL Top10感受态细胞中, 冰浴30 min, 42℃热激45 s, 再在冰上放置1 min; 加入800 μL LB液体培养基(无抗生素)。混匀, 37℃、150转 min–1摇床振荡1 h; 取200 μL菌液铺于含Amp (50 μg μL–1)的LB固体培养基上, 37℃平放20 min, 后倒置培养12~14 h。挑取阳性克隆于含有Amp的LB液体培养基上, 37℃、250转min–1摇床振荡8~10 h, 用TIANpure Midi Plasmid Kit 试剂盒(天根)提取质粒DNA, 分别通过PCR检测和Bam H І、Sac І酶切鉴定, 并将5个克隆送至生工生物工程(上海)有限公司测序。
1.2.3 青稞blt4.9基因分析及结构特性预测采用ExPasy网站的在线工具ProtParam (/tools/protparam.html)计算克隆基因编码蛋白质的等电点和分子量, 预测蛋白的性质和结构; 通过蛋白质预测服务器(npsa-pbil.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)
分析蛋白质二级结构, 通过DNAstar7.1软件的Protean模块, 分别应用Garnier-Robson、Deleage-
第3期姚晓华等: 青稞脂质转运蛋白基因blt4.9的克隆及其对非生物胁迫的响应401
Roux、Hydropathy-Kyte-Doolittle、Karplus-Schulz、Emini计算氨基酸残基的特定结构域、蛋白质的二级结构、蛋白质的疏水区和亲水区、蛋白质骨架区的柔韧性以及蛋白质表面的可能性。
1.3 blt4.9基因在非生物胁迫下的表达
1.3.1 胁迫处理按前述方法在人工气候箱中培养青稞幼苗, 待幼苗长至约10 cm高时(约2周)分别进行干旱(PEG-6000)、低温(4℃)和ABA处理, 胁迫处理期间, 每天向滤纸加相应溶液数滴, 以浸透滤纸并稍有剩余为标准, 尽量减少水势变动。PEG- 6000 (0、5%、10%、15%、20%、25%、30%)和ABA (0、5、10、50、100、200、500 μmol L–1)处理1 d 后, 低温处理0、12、24、48 h后, 分别提取叶片总RNA, 用PrimeScriptRT Master Mix (TaKaRa)试剂盒反转录合成cDNA, 用于检测blt4.9基因的表达量。
1.3.2 引物设计根据测得的blt4.9序列, 在开放阅读框(ORF)内设计荧光定量PCR引物P2 (F: 5′- AAACCGCCTGTGACCT-3′; R: 5′-CACGCCGCTTG CTTGT-3′), 利用稳定表达的18SrRNA作为内参基因, 其引物(P3)序列为F: 5′-AAACCGCCTGTGA CCT-3′; R: 5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3′。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.3.3 Real-time PCR反应程序采用Bio-Rad公司iQ5荧光定量PCR仪, 按照生工生物(上海)有限公司的荧光试剂盒Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits (SYBR Green I)分别建立目的基因和内参基因的反应体系, 其组成为cDNA 4
2.5 ng,10 μm L–1 P2/P3上下游引物各0.5 μL, Hotstart Fluo-PCR mix 12.5 μL, 加ddH2O至25 μL。反应参数为, 95℃3 min; 95℃ 10 s, 61℃ 30 s, 95℃ 1 min, 61℃ 1 min, 40个循环。
1.3.4 基因表达分析采用2 Ct法计算基因相对表达量[13], 干旱和低温胁迫以旱地紫无胁迫处理的表达量为1; ABA胁迫以0 μmol L–1 ABA处理昆仑12的表达量为1。用Stst2与SPSS13.0进行方差分析和多重比较。用Origin 8.0制作柱状图。
2 结果与分析
2.1 青稞blt4.9基因的克隆
用设计的特异引物扩增得到一条约800 bp的特异性片段, 与预期结果相符。将该条带纯化后与pMD20-T克隆载体连接, 并转入大肠杆菌, 在含有Amp的LB培养基上通过蓝白斑筛选得到阳性克隆。分别对阳性克隆进行PCR和酶切鉴定, 随机选取5个经鉴定为阳性的克隆进行测序。
测序结果表明, blt4.9基因全长为720 bp, 其ORF为348 bp, 编码115个氨基酸(图1)。氨基酸组分分析结果显示, blt4.9富含Ala (23.48%)、Ser (11.3%)、Val (8.7%)、Gly (8.7%)、Cys (6.96%)、Ile (6.09 %)和Lys (6.09 %), 不含Trp、Glu和Phe。这与已报道的其他冷诱导基因编码蛋白氨基酸组成[14-15]相似。
图1青稞品种昆仑12中blt4.9基因的序列
Fig. 1 Sequence of blt4.9 gene from hulless barley variety Kunlun 12台湾当局
402作物学报第42卷
上苇甸村2.2青稞blt4.9基因及其编码产物分析
Blast分析结果表明, 青稞blt4.9基因编码的氨基酸序列与几个大麦blt基因编码产物的同源性很高(图2-A), 均在96%以上, 尤其与大麦blt4.9编码蛋白的同源性最高, 达98.3%; 其次是与硬粒小麦、黑麦(blt4.9)和普通小麦blt4编码蛋白的同源性, 分别为81%、77%和72%; 与粳稻blt4.9编码蛋白的同源性最低, 仅为62%。通过DNAStar得到分离自不同物种blt4.9基因的系统进化树(图2-B)显示了与Blast 比对一致的结果, 其原因可能是青稞与大麦同属大麦属, 而且blt家族的基因都报道是低温反应相关的基因。
利用DNAStar7.1软件中的Protean模块计算得知, blt4.9是编码115个氨基酸的小分子蛋白质, 分子量为11.2 kD, 等电点为9.04, 是一个碱性蛋白, 其分子量介于9.9~11.9 kU之间, 推测属于LTP I家族[16]。利用软件预测blt4.9编码蛋白的性质和结构, 表明该蛋白的不稳定系数为28.41, 说明这是一个稳定的蛋白质; 脂肪系数为92.78, 总平均亲水性为0.597。且蛋白二级结构主要由α-螺旋(48.70%)、β-折叠(7.83%)和无规则卷曲(43.48%)构成(图3); 绝大多数结构位于疏水区, 没有形成较大的亲水区(图4)。
2.3 blt4.9基因在逆境胁迫下的表达分析
2.3.1 blt4.9在干旱和低温胁迫下的表达以PEG-6000模拟干旱胁迫24 h, 当PEG-6000浓度在5%~15%时, blt4.9表达量虽有提高, 但增加幅度不明显; 随着干旱胁迫程度的增加, 当PEG-6000浓度为20%时基因表达量显著增加(P<0.05); 当25% PEG-6000处理时, 基因表达量达到峰值, 约为对照的53.04倍(旱地紫)和24.18倍(); 当PEG-6000浓度为30%时, 表达量仍显著高于对照。并且在模拟干旱胁迫下, blt4.9基因在抗旱性强的品种(旱地紫)中的表达量显著高于在抗旱性弱的品种()中(图5-A)。
图2不同物种blt4基因编码氨基酸序列的同源性比较(A)和系统进化树分析(B)
Fig. 2 Analysis of amino acid sequences (A) and phylogenetic tree (B) of blt4 genes from different species
地牢围攻3联机
A: 昆仑12 blt4.9; B: 大麦blt4.2 (Q43785); C: 大麦blt4.3 (Q42842); D: 大麦blt4.1 (Q43767); E: 大麦blt4.9 (U63993.1); F: 硬粒小麦blt4 (AEG47274); G: 小麦blt4 (AAV66924); H：黑麦blt4.9 (ABG27011); I: 粳稻blt4.9 (AAA74624)。
A: blt4.9 from Kunlun 12; B: blt4.2 of Hordeum vulgare (Q43785); C: blt4.3 of Hordeum vulgare (Q42842); D: blt4.1 of Hordeum vulgare (Q43767); E: blt4.9 of Hordeum vulgare (U63993.1); F: blt4 of Triticum durum (AEG47274); G: blt4 of Triticum aestivum (AAV66924);
H: blt4.9 of Secale careale (ABG27011); I: blt4.9 of Oryza sativa (AAA74624).
第3期
姚晓华等: 青稞脂质转运蛋白基因blt4.9的克隆及其对非生物胁迫的响应 403
图3 SOPMA 软件预测blt4.9的二级结构
Fig. 3 Secondary structure of the blt4.9 analyzed by SOPMA
卷曲、螺旋、延伸链分别用粉、蓝和红线条表示。
Curly, helix and extension chain are indicated with pink, blue, and red lines, respectively.
图4 blt4.9编码蛋白质二级结构、疏水性以及抗原分析
Fig. 4 Secondary structure, hydrophilicity, and antigenic analysis of blt4.9
4℃低温胁迫0~48 h, 旱地紫和两品种的blt4.9基因表达量都随胁迫时间的延长而显著增加, 并且在耐冷性较强的旱地紫中表达量高于在耐冷性较弱的中(图5-B)(P <0.05)。
2.3.2 blt4.9在ABA 胁迫下的表达 0~500 μmol L -1 ABA 胁迫处理下, 随着外源ABA 浓度的增加, blt4.9基因表达量呈先增加后降低的趋势, 50 μmol L –1 ABA 处理的表达量最高, 为对照的8.96倍(P <0.05); 100~500 μmol L –1 ABA 胁迫下, blt4.9基因表达量均低于对照, 但与对照差异不显著(图6)。
3 讨论
植物在遭遇低温胁迫时, 会诱导多种在转录水平调节的启动子区域有一个cis 作用元件(TACCG ACAT)基因表达, 受冷调节信号作用, 称为脱水反应因子DRE [17]。国内外对大麦blt 基因家族各成员研究比较多, 何涛和贾敬芬[15]、邓晓青等[18]都克隆了青稞blt14.2基因, 证明该基因是低温专一诱导基因, 在组织中特异性表达, 在植物的抗寒中具有一定的作用。White 等[19]用低温感应基因blt4.1作为探
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议