生物技术实验报告
姓名：张龙龙
学号：2011506066
班级：11级生技02班
前言：绿荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生团则位于大空腔内。发团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的
2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。
3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。 二．实验原理
基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。
本实验根据绿荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达
3. 实验材料及仪器
1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21；
2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、企业改革与管理PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。
四.实验内容
4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定：
1) 实验试剂：LB培养基；溶液Ⅰ；Tris-HCl（pH=8）；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸染剂；1%的琼脂糖凝胶；XhoⅠ(10U/μl)；NdeⅠ（10U/μl）；T4 DNA lisase。
2) 实验步骤：
质粒的提取与鉴定
（1）在含有质粒的DH5α平板菌落上挑取单菌落，接种于20ml含有100μl /ml Apm的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。
（2）分装菌液到1.5ml离心管中，冰浴2min。4℃、12000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。再用同样方法收集一次菌体。
（3）将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，涡旋剧烈振荡 ，混匀，冰浴10min。
（4）加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管5次，充分混匀，冰浴5min。
（5）加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，见白絮状沉淀，可在冰上放置10min。4℃、12000rpm 离心10min。
（6）加等体积的酚/氯仿（1：1），震荡混合有机相和水相，冰浴3min。4℃、12000rpm 离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中。
（7）加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），振荡混合有机相和水相，4℃、12000rpm 离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中。
（8）加入2倍体积预冷的无水乙醇，考古墓地-20℃沉淀DNA 10-20min。4℃、12000rpm 离心10min，弃上清，留沉淀（管底有少量白沉淀）。
（9）分2次加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀， 12000rpm 离心5min，抽吸去除所有上清，放置室温干燥，让酒精挥发。
（阿格尔10）加30μl TE（内含浓度50μg/ml的RNase A）溶解DNA，37℃放置30min，消化RNA。-20℃保存备用。
（11）制1%的琼脂糖凝胶：加25ml×TAE缓冲液于三角瓶。称取徐重阳0.25g琼脂糖加到三角瓶中，与微波炉加热至完全溶化。冷却至60℃左右，加1μl的GoldView溶液，摇匀。轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30min以上。轻轻拔掉梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（TAE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm。
（12）点样：取5μl质粒DNA及2μl加样缓冲液混合上样，80—100v约电泳20—30min。
质粒DNA的酶切
（1）酶切：按如下双酶切体系（20μl）混合
反应物 | Ⅰ | Ⅱ |
质粒 | 5μl | 3μl |
XhoⅠ(10U/μl) | 0.5μl | 0.5μl |
NdeⅠ（10U/μl） | 0.5μl | 0.5μl |
10×buffer | 2μl | 2μl |
ddH2O | 12μl | 14μl |
| | |
先加水，再加buffer，加质粒，加内切酶，放离心机上混匀。在37℃水浴4h。
（2）电泳，在紫外观察分析仪上观察酶切结果。
4.2目的基因的获得和重组载体的构建
1) 实验试剂：模板DNA；dNTP；Taq DNA聚合酶；引物；10×buffer（内含Mg2+）；ddH2O；10×T4DNA连接酶buffer；T4DNA连接酶。
2) 实验步骤：
目的基因的获得、检测及回收
（1）依次混匀下列试剂：反应体系
ddH2O | 9.5 μl |
Mix | 12.5 μl |
上游引物 | 1 μl |
下游引物 数学最高奖女得主 | 1 μl |
模板 | 1 μl |
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混合后瞬时离心。
（2）PCR反应程序
94℃ 预变性 3 min
94℃ 变性 30 sec
52℃ 退火 30 sec 30个循环
72℃ 延伸 1 min
72℃ 延伸 1 min
4℃
（3）电泳：扩增产物用1% 的琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
（4）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。
（5）以0.1g 凝胶对应300μl 的体积加入PN。
（6）50℃ 水浴10min ，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解。
（7）将上一步的到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管中，13000rpm 离心60s，弃掉废液。
（8）加入800μl漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。
（9）加入500μl漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。
（10）将离心吸附柱放回收集管，13000rpm离心2min。
（11）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB 30μl，洗脱缓冲液在65℃水浴中预热，室温放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回到离心吸附柱中，13000rpm离心1min。
（12）电泳检测回收产物，余置于-20℃保存。
重组质粒的连接
将PCR扩增的目的基因片段产物与PGM-T载体连接。反应体系（μl）如下；
体系成分 体积（μl）
溶液Ⅰ 5
PGM-T载体 0.2场所精神
目的基因产物 4.8
将反应液混合，16℃ 30 min。
4.3感受态细胞的制备及转化
1) 实验试剂:LB培养液；0.1mol/L CaCl2溶液；E.coli DH5α受体菌（R-M-）；LB培养基；氨苄青霉素；IPTG；X-gal。
2) 实验步骤
感受态细胞的制备
（1）活化E.coli DH5α菌株：将实验室保存的E.coli DH5α菌株甘油管用无菌去离子水1:100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。
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