江苏农业学报（Jiangsu J．of Agr．Sci．），2012，28（4）：697 702常闪闪，肖姗姗，张磊，等．水稻OsSsr1基因的生物信息学分析、亚细胞定位及其表达模式［ J ］．江苏农业学报，2012，28（4）：697-702．
水稻OsSsr1基因的生物信息学分析、亚细胞定位及其
表达模式
常闪闪，肖姗姗，张
磊，李文奇，刘凤权，邵
敏
（南京农业大学植物保护学院，农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室，江苏南京210095）
收稿日期：2012-05-03基金项目：国家“863”项目（2008AA10Z108、
2007AA10Z188）；国家转基因生物新品种培育项目（2009ZX08001-005B ）作者简介：常闪闪（1986-），女，河南许昌人，硕士研究生，研究方向为
分子和生理植物病理学。（E-mail ）2009102043@njau．edu．cn
通讯作者：邵
敏，
（E-mail ）minshao@njau．edu．cn 摘要：
为了探明盐敏感相关基因［OsSsr1（Oryza sativa L．salt -
sensitive related gene 1，GenBank 登录号为NM_001065574）］的亚细胞定位及在水稻不同组织和各种逆境胁迫下的表达模式，通过生物信息学手段、洋葱表皮亚细胞定位、RiceXPro 数据库和Real-time PCR 对其进行研究。序列分析表明OsSsr1的开放阅读框为2004bp ，编码一个由667个氨基酸组成并含有5个跨膜区的蛋白质，该蛋白质N 端含有一个信号肽；其启动子序列包含TGACG-motif 、ABRE 、TCA-element 和W box 等多个与逆境相关的顺式作用元件。GFP 融合表达显示，OsSSR1蛋白质定位于细胞膜。RiceXPro 数据库中数据分析表明，OsSsr1基因在水稻不同发育期的不同组织中均有表达，在叶中的表达量最高，胚中的表达量最低。Real-time PCR 结果表明，OsSsr1表达水平受干旱、高温、高盐、低温、机械伤害、稻瘟病菌、 MeJA 和ABA 的诱导上调。这些结果显示，OsSsr1基因可能在水稻胁迫反应中发挥重要作用。关键词：
水稻；OsSsr1；启动子；亚细胞定位；表达分析
中图分类号：
S511．035．3
文献标识码：
A
文章编号：
1000-4440（2012）04-0697-06
Bioinformatic analysis ，subcellular localization and expression pattern of OsSsr1gene in rice
CHANG Shan-shan ，XIAO Shan-shan ，ZHANG Lei ，LI Wen-qi ，LIU Feng-quan ，SHAO Min
（College of Plant Protection ，Nanjing Agricultural University ，Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests ，Ministry of Education ，Nanjing 210095，China ）
Abstract ：To analyze the subcellular localization and expression pattern of rice salt-sensitive gene ［OsSsr1gene
（Oryza sativa L．salt-sensitive related gene 1，GenBank accession ：NM_001065574）］in different tissues and various envi-ronmental stimulus ，bioinformatics methods ，subcellular localization ，RiceXPro database and Real-time PCR were used to study this gene．The sequence analysis showed that OsSsr1consisted of an ORF with a length of 2004bp ，encoded a 667amino acids protein containing five transmembrane regions ，and also contained a signal peptide in the N-terminal domain．The promoter sequence contained several stress-related cis-acting elements ，such as TGACG-motif ，ABRE ，TCA-element ，and W box．The expression of OsSSR1-GFP fusion protein suggested that OsSSR1protein mostly appeared in cell mem-brane．The analysis of expression data in RiceXPro
database revealed that OsSsr1was expressed in different tissues at each development stage of rice ，the highest ex-pression in leaf ，the lowest in embryo．The real-time PCR analysis indicated that OsSsr1was up-regulated by kinds of environmental stimulus ，including drought ，high tempera-ture ，high salt ，low temperature ，wound ，Magnaporthe grisea ，MeJA and ABA．These findings indicated that
7
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OsSsr1might play an important role in rice resistance to kinds of stresses．Key words：rice；OsSsr1；promoter；subcellular localization；expression analysis
水稻是中国也是全世界重要的粮食作物之一，然而水稻在生长发育过程中常常受到干旱、低温和高盐等非生物胁迫，严重影响水稻的产量和品质。因此，分离鉴定水稻耐逆相关基因，培育耐逆品种，对水稻的高产稳产具有重要意义。植物在干旱、高温等逆境条件下，大量的基因被诱导表达而产生胁迫响应［1］。植物中参与逆境应答的基因主要分为2类：一类是效应基因，直接参与代谢变化等生化过程，产生耐逆效应，包括渗透保护物质、活性氧清除酶类相关基因、LEA蛋白质和热激蛋白质等；另一类是调控基因，通过调控其下游相关逆境诱导基因的表达而发挥作用，包括转录因子和信号传导基因。目前已鉴定出多个与逆境相关的顺式作用元件［2-6］，也鉴定出一些与这些元件相结合的转录因子，如AP2/EREBP、bZIP、NAC、MYB和WRKY等［7］，它们中的大多数在干旱、低温等逆境胁迫下受ABA诱导表达［8］。
一些研究结果表明，来自水稻黄单胞菌（Xan-thomona s oryzae pv．oryzae）的Harpin蛋白质的编码基因hrf1转化水稻，能够提高其对稻瘟病、水稻白叶枯病和干旱的抗性［9-11］。封伟等［12］利用
农杆菌介导法将OsSsr1基因转入烟草，提高了烟草在盐胁迫下脯氨酸的积累水平和活性氧清除能力，从而增强了其对NaCl的耐受能力。虽然过量表达OsSsr1可显著提高转基因植株的抗逆能力，但其序列结构特征、表达模式仍不清楚。本研究利用生物信息学和分子生物学手段，分析了水稻OsSsr1基因结构、启动子元件，构建GFP融合表达载体，研究其亚细胞定位，并应用实时荧光定量PCR技术分析了该基因在逆境胁迫下的表达模式。
1材料与方法
1．1试验材料与处理
以粳稻日本晴（Oryza sativa L．subsp．Japoni-ca）为试验材料。挑选大小均匀的日本晴种子，用30%NaClO消毒30min，灭菌水冲洗5次，28ħ黑暗催芽3d，再转到光照培养箱（30000lx，14h）中用木村B营养液水培育苗至三叶期进行处理。参照Zhang等［13］的方法用ABA和MeJA喷施水稻幼苗；将水稻幼苗根系直接暴露于空气中进行脱水干旱处理；在42ħ和4ħ培养箱中进行高温和低温处理；将水稻幼苗于含200mmol/L NaCl的木村B营养液中进行高盐处理；用灭菌剪刀对水稻幼苗叶片进行机械损伤处理；对水稻幼苗进行稻瘟病菌喷雾接种。
1．2RNA的提取与cDNA的合成
参照Invitrogen公司的PureLink TM RNA Kit说明书提取水稻叶片总RNA，用分光光度计检测核酸的含量。总RNA用DNaseⅠ（TaKaRa）处理30min，去除微量基因组DNA，以1%的非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。反转录参照Invitrogen公司M-MLV反转录酶使用说明进行cDNA第一链合成。1．3生物信息学分析
用ExPASy网站的ProtParam（http：//web．ex-pasy．org/protparam/）预测蛋白质的分子量和等电点；TMHMM Server v．2．0（http：//www．cbs．dtu．dk/ services/TMHMM/）检测蛋白质的潜在跨膜区；Sin-galP3．0（http：//cbs．dtu．dk/services/SignalP/）对OsSSR1进行信号肽预测；TargetP（http：//www．cbs．dtu．dk/services/TargetP/）对OsSSR1进行亚细胞定位预测［14］；NLStradamus（http：//www．moseslab．csb．utoronto．ca/NLStradamus/）进行核定位信号预测［15］；用MEGA4．0［16］软件中的Neibor-joining算法构建系统发育树；CD-Search（www．ncbi．nlm．nih．gov/Structure/cdd/wrpsb．cgi）分析OsSSR1的结构域；PlantCARE（http：//bioinformatics．psb．ugent．be/ webtools/plantcare/html/）程序预测分析OsSsr1启动子元件。
1．4OsSSR1-GFP融合蛋白质的亚细胞定位分析用特异性引物（上游引物：5'-CGGGATCCAT-GAAGGATTTTATGAAACTTTATCATC-3'，下游引物：5'-CGGGATCCGTTGAAAAAGAACGCATATGCTT-3'），扩增OsSsr1全长编码序列，PCR产物用Bam
HⅠ酶切，连入pCXDG载体，重组质粒通过农杆菌介导的方法转化洋葱表皮细胞，转化24 48h后，在绿荧光下观察OsSSR1-GFP融合蛋白质的分布［17］。1．5OsSsr1表达的Real-time PCR分析
OsSsr1和内参EF1α实时定量引物的设计使用Primer5．0软件完成，具体序列如下：EF1α-qf：5'-
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CTTCAACACCCCTGCTATG-3'，EF1α-qr：5'-CCGTT-GTGGTGAATGAGTAA-3'；OsSsr1-qf：5'-CCTCTCAC-GACACGATG-3'，OsSsr1-qr：5'-GATGCCTCAGCCA-CAAG-3'。Real-time PCR使用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq TM体系，于Applied Biosystems7500实时定量PCR仪上进行，每个样本重复3次，试验设3次重复。扩增程序为95ħ30s；95ħ5s，60ħ34 s，40个循环，循环结束后，利用溶解曲线检测引物特异性；采用2－△△C T法分析数据，确定基因的相对表达量，其中△△C T=（C T-OsSsr1－C T-EF1a）胁迫处理－
（C
T-OsSsr1－C
T-EF1a
）
对照
。
2结果
2．1OsSsr1基因序列
edx
序列分析表明，OsSsr1完整的开放阅读框为2004bp，编码一个由667个氨基酸组成的蛋白质。BLAST N比对水稻基因组序列发现OsSsr1位于水稻的第7号染体反义链上，CDS区为4230181 4226648bp，其DNA序列不含内含子。并在分析中发现在籼稻数据库中也有一个同源基因BGIOSGA024717，在基因组上位置类似，氨基酸序列比对表明仅在第457位残基由缬氨酸代替了甲硫氨酸。ProtParam分析显示，OsSSR1的理论分子量为75131，理论等电点为7.38，在生理条件下，OsSSR1带正电。使用TMHMM Server v．2．0对OsSSR1的潜在跨膜区进行分析，结果显示，OsSSR1中含有5个跨膜区。SingalP3．0分析显示，OsSSR1蛋白质的N端包含一个信号肽，预测剪切位点位于第27和28个氨基酸残基之间。NLStradamus分析结果显示，OsSSR1中也不包含明显的核定位信号。
CD-Search分析发现OsSSR1蛋白质含有DUF594（Domain Unkown Family594）和DUF4220（Dom
ain Un-kown Family4220）2个保守结构域，这2个结构域都是未知功能的结构域。利用HMMER［18］模型，数据库关键词搜索等方法从水稻数据库中鉴定出所有含DUF594或者DUF4220结构域的蛋白质。再用KEGG、PFAM和SMART数据库验证这些蛋白质是否含DUF594或者DUF4220结构域。对水稻基因组中所有含DUF594或者DUF4220结构域的蛋白质进行分析，发现这2个结构域大多出现在同一条序列里，少有单独出现，其中粳稻基因组中同时含有2个功能域的蛋白质有38个，只含有DUF594功能域的蛋白质有7个，而只含有DUF4220功能域的蛋白质有9个。同时用Clustal W软件对这54个蛋白质进行多序列比对，人工检查，再利用MEGA4．0软件中的Neibor-joining算法构建系统发育树，发现OsSSR1（Os07g0180300）与Os01g0343100、Os05g0324300、Os08g0216000同时含有DUF594和DUF4220结构域，处于同一子分支上。2．2OsSsr1基因的启动子序列
为了进一步了解OsSsr1的表达调控机制，根据NCBI上公布的日本晴全基因组序列，选取OsSsr1 CDS区上游约1200bp的核苷酸序列作为启动子进行PlantCARE在线分析，发现除含基本启动子元件TATA-box和CAAT-box外，还含有多个与胁迫响应相关的顺式作用元件，包括MeJA响应元件TGACG-motif，光响应MYB结合位点MRE；脱落酸响应元件ABRE，水杨酸响应元件TCA-element，真菌诱导响应元件Box-W1，抗病响应元件W box及激发子和病原菌响应元件Box S等。这些结果表明，OsSsr1可能通过这些顺式作用元件参与了水稻对胁迫信号传导途径的应答，在植物响应胁迫过程中发挥作用。2．3OsSSR1-GFP融合蛋白质亚细胞定位
为了研究OsSSR1的亚细胞定位，用TargetP进行预测，结果显示OsSSR1序列中不包含明显的叶绿体转运肽和线粒体靶向肽，包含一个分泌通路信号肽，构建35S-OsSSR1-GFP瞬时表达载体，并在洋葱表皮上进行检测。35S-GFP分布于整个细胞，而35S-OsSSR1-GFP分布于细胞膜。
2．4OsSsr1基因在水稻各个组织中的表达
利用RiceXPro数据库搜索OsSsr1基因在水稻各个组织和整个生长发育期叶片中的表达量数据，通过分析发现，OsSsr1基因在水稻的各个组织中均有不同程度的表达，但在叶片和叶鞘中的表达量最高，其次为根，在茎、内外稃、穗部、雌蕊、花药、子房、胚乳和胚等组织中表达量较低，在胚中的表达量最低，表明OsSsr1参与了水稻各个组织的生长和代谢过程，对水稻叶和根生长发育的作用可能大于其他组织。OsSsr1基因在水稻整个生长发育期叶片中的表达量数据显示，OsSsr1在营养生长期的表达量逐渐升高，在生殖生长期和成熟期的表达量最高。说明与营养生长期相比，OsSsr1基因可能与水稻生殖生长期的生长关系更为密切。
2．5OsSsr1基因的诱导表达
为了解OsSsr1在各种胁迫下的表达模式，用干
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常闪闪等：水稻OsSsr1基因的生物信息学分析、亚细胞定位及其表达模式
旱、高温、高盐、低温、机械伤害、稻瘟病菌、
ABA 和MeJA 等分别处理水稻幼苗，采用Real-time PCR 分析OsSsr1表达变化（图1）。干旱、高温、高盐、低温和机
械伤害代表5种非生物胁迫，
外相
ABA 一般是非生物胁迫的信号物质。结果表明，
OsSsr1基因在各种胁迫下均存在表达上调趋势，但是表达模式存在差异。在机械伤害胁迫下，OsSsr1快速响应，表达量在处理1h 时达到最高水平；在干旱、高温、高盐和低温胁迫下，表达
量均在处理3h 时达最高水平；在稻瘟病菌处理下，
表达量在处理12h 时达到最高水平；在ABA 和MeJA 处理下，
OsSsr1均在处理6h 时达到最高水平。由此推断，OsSsr1可能参与水稻对干旱、高温、高盐、低温、机械伤害、稻瘟病菌、
ABA 和MeJA 胁迫的早期应答，并在应答模式上存在差别；OsSsr1对非生物胁迫的响应可能依赖于ABA 信号转导途径
。
图1在各种胁迫处理下OsSsr1的表达
Fig．1
Expression of OsSsr1in differently stressed rice treated
007江苏农业学报2012年第28卷第4期
3讨论
水稻是中国主要的粮食作物，然而高温、低温、干旱、病害和土壤盐渍化等不良环境因素每年都会对水稻产量造成极大影响，因此，运用分子生物学技术研究其抗逆机制显得尤为重要。本试验结果显示，作为转hrf1水稻的转基因系NJH12转录谱中的表达上调基因OsSsr1，其上游约1200bp的启动子序列中含有多个与逆境相关的顺式作用元件，当外界存在刺激时，胁迫相关转录因子通过调控这些诱导元件，可以迅速激活OsSsr1的表达，提高其蛋白质表达量，为OsSsr1应答逆境信号提供了依据。SingalP预测分析显示，OsSSR1蛋白质N端有一个27个氨基酸残基的信号肽，OsSSR1-GFP融合表达结果表明其定位于细胞膜上，推测OsSSR1可能是一个分泌蛋白质。
植物在逆境条件下，体内会发生一系列变化以适应胁迫环境，如可溶性蛋白质的增加，细胞膜组分的改变，可溶性糖与脯氨酸含量的积累以及活性氧清除能力的增强等［19-21］。封伟等［12］研究结果表明，将OsSsr1基因转入烟草，MDA的积累速率明显低于野生型，SOD和POD的升高速率明显高于野生型，OsSsr1基因的表达提高了转基因株系在盐胁迫下脯氨酸的积累水平和活性氧清除能力，从而增强了其耐盐性。本研究中OsSSR1含有DUF594和DUF42202个保守结构域，但这2个结构域的功能未知，我们推测OsSsr1的耐逆性可能与DUF594和DUF4220功能区有关。另外，对OsSSR1家族蛋白质构建系统发育树，分析发现OsSSR1与Os01g0343100、Os05g0324300、Os08g02160003个蛋白质处于同一子分支上，对这3个蛋白质的结构域进行分析发现，它们均含有DUF594和DUF42202个功能域，另外，Os05g0324300除了含有DUF594和DUF42202个功能域外还含有DUF525功能域。
本试验结果显示，OsSsr1基因在水稻根、茎、叶、内外稃、穗部、雌蕊、花药、子房、胚乳和胚中都有不同程度的表达，不具有组织特异性，在水稻叶部和根部表达量最高，说明OsSsr1参与了水稻各个组织的生长和代谢过程，对水稻叶和根生长发育的作用可能大于其他组织。另外，干旱、高温、高盐、低温、机械伤害和稻瘟病菌胁迫可诱导OsSsr1表达量显著上调，但其表达量有所差异；OsSsr1在响应ABA和MeJA外源激素信号分子时，表达量也上调，但ABA 对OsSsr1的诱导作用明显，MeJA对OsSsr1的诱导作用并不明显。这些结果表明，OsSsr1对非生物胁迫的响应可能依赖于ABA信号转导途径，且其对逆境胁迫和外源信号分子的刺激可能具有不同的应答模式。以上结果与OsSsr1启动子中含有逆境相关诱导元件相符，表明了OsSsr1基因可能在水稻胁迫反应中发挥重要作用。
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(责任编辑：袁伟)
207江苏农业学报2012年第28卷第4期
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