前言
大分子生物制药市场近几年急速增长，已经突破千万亿大关。2017年全球最畅销的10大药物中，大分子占8个，小分子只有2个，因此大分子药物研发成为近几年各大药厂和资本追逐的重要领域。在生物制药研发过程中，生产大分子药物的稳定细胞株的开发是整个药物研发和生产中最重要的步骤，因此选择合适的细胞株开发的方法是每一个生物药企需要仔细甄选的环节。
一．传统细胞株开发系统的局限性
传统的细胞株开发方法，有DHFR缺陷的CHO系统和GS-CHO 系统：
∙DHFR缺陷的CHO系统：以DG44细胞株为代表，这是一种二氢叶酸还原酶（DHFR）缺陷型细胞，在缺乏次黄嘌呤-腺嘌呤（HT）培养基中不能生长，当转入携带有DHFR的基因后可以生长，并且DHFR可以被甲氨蝶呤（MTA）抑制，通过增加MTA的浓度、DHFR基因的扩增，伴随着目的基因扩增，从而达到高表达细胞株的筛选。 ∙GS-CHO系统：分别以CHOK1SV 为代表的谷氨酰胺合成酶存在（低表达）的细胞和GS-KO 为代表的谷氨酰胺合成酶敲除的细胞。在CHOK1SV细胞中，在缺乏谷氨酰胺的培养基中生长缓慢，GS抑制剂，L-氨基亚砜蛋氨酸（Methionine Sulphoximine MSX），可用于抑制内源性GS活性，只有转染了额外GS基因可以生存。因此同样可以通过增加MSX的浓度，来增加GS基因的拷贝数同时伴随着目的基因的拷贝数的增加，从而达到高表达细胞株的筛选。
∙DG44和CHOK1SV系统缺点：均是依靠基因拷贝数扩增的高表达细胞株筛选方法，但加压筛选往往会带来细胞株不稳定的问题，在去除筛选药物后，表达量可能会出现大幅的下降。高拷贝带来的高表达经常会出现拷贝数丢失，而引起产量下降甚至丢失的问题。更有甚者，在高选择压力情况下，会出现部分细胞株为适应高选择压力而出现目的基因突变的问题。另外，对于DHFR系统，多轮的的加压筛选，也带来了筛选周期过长的问题，一般需要长达6-12个月的筛选周期，不能满足现代快速的药物开发需求。
如下图1、2分别展示了对DHFR系统、GS系统的稳定性评价的数据[1-2]：蓝刀锋
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图1. 对DHFR系统稳定性评价的数据[1]
图2. 对GS系统稳定性评价的数据[2]
二．FACS是最有效的筛选方式
非加压筛选模式，即不是通过目的基因拷贝数增加来筛选高表达细胞株的方式，必然是相对稳定的细胞株筛选方式。Lonza开发了GS-KO系统，将谷氨酰胺合成酶的基因完全敲除，只有携带GS基因的细胞在缺乏谷氨酰胺的培养基中生长，因此不需要MSX的加压筛选，伴随GS基因表达的目的基因表达的细胞同时也能被筛选出来。在这种方式中，GS基因仅作为筛选标记出现。其他筛选标记，如各种抗生素筛选标记，也可以起到相同的作用。
分数布朗运动然而对于这些非加压筛选模式，如何在众多的高低表达不同的细胞中，将高表达细胞株筛选出来，是一个很大的问题。各个厂家想出了各种不同的高表达细胞株筛选方法，比如ClonePix以及类似的仪器，但即使是借助这样的机器，通量上也不能做到很大（约1000）。在所有高通量筛选细胞的方法中，FACS是最有效的筛选方式，FACS每小时可以筛选10标贴设计7个细胞。
如何才能利用FACS进行有效的细胞筛选呢？只有荧光标记能代表目的基因表达量的时候，FACS才能对高表达细胞起到有效的筛选。近年来，很多公司都想出不同的方式，利用FACS进行高表达细胞株的筛选。
中国人民解放军军事学院图3显示了Lonza公司开发的一种系统，通过在细胞表面固定生物素，利用生物素-亲和素-ProteinA 捕获分泌的抗体，随后通过荧光标记的二抗来标记细胞膜表面的抗体，再利用FACS筛选荧光强的细胞，从而实现高表达细胞株的筛选，这种方式步骤繁琐（需要细胞表面固定生物素），最大的问题是背景难消除，很难保证捕获的抗体是由自身细胞分泌的抗体。
图3. Lonza公司开发的一种系统
后来Regeneron开发了类似的、比Lonza更优越的FACS 筛选系统，通过共表达的CD16a捕获抗体以辅助二抗荧光标记，但它同样存在背景难去除的问题，不能保证捕获的抗体就是本细胞分泌的抗体。图4显示了Genzyme开发的共表达系统，通过共表达细胞膜蛋白CD52或者CD20以代表目的蛋白的表达量，利用对CD52/CD20的荧光标记来筛选目的蛋白的高表达细胞株，这个系统的缺点就是引入了其他的分子，在药物开发的后期无法去除。
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