抗癌产生耐药性的原因除了遗传性改变，另一个主要原因是持久性耐药细胞的产生。持久性细胞（PS）获得非突变的瞬时药物耐受表型，在靶向和常规过程中逃避凋亡。PS在功能上可定义为细胞死亡诱导处理后没有发生耐药突变仍存活的细胞，其表型特征已基本研究清楚，包括：1）瞬时性耐药；2）对脂质过氧化物酶GPX4的依赖性；3）减少细胞周期动力学；4）相似的基因表达谱，统称为EMT（上皮间质转化）特征。但是，PS在促凋亡的抗癌药物中存活的分子机制还不清楚。FOREWORD 2022年9月，圣裘德儿童研究医院的涨潮海岸Douglas R.Green团队在《Cell》上发表了题为“Sublethal cytochrome c release generates drug-tolerant persister cells”的文章。
该研究发现使用促凋亡BH3类似物处理后仍存活的癌细胞是通过亚致死性线粒体外膜通透（MOMP）和细胞素c诱导产生应激反应而存活下来的，但这种应激反应与caspases无关。癌细胞因此获得一种持久性状态，能够促进体内转移。 原文链接：/10.ll.2022.07.025
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文章中用于荧光辅助细胞筛选分析的GFP-Booster Alexa Fluor® 488、RFP-Booster Alexa Fluor® 568，以及用于免疫沉淀的GFP-Trap® Magnetic Agarose均来源于Proteintech旗下品牌Chromotek。
研究内容
细胞凋亡可被外在死亡受体途径和内在线粒体途径诱导。其中内在线粒体途径的关键步骤是线粒体外膜通透性改变，该过程由BCL2家族效应蛋白BAX、BAK、BOX负责。
线粒体外膜渗透（MOMP）发生后，线粒体蛋白（如细胞素c）被释放到胞质，激活caspase启动细胞凋亡。促凋亡BH3-only蛋白利用其BH3结构域结合BAX和BAK从而参加MOMP。BH3类似物也是通过此功能促进细胞凋亡。
作者此前的研究发现凋亡级联的启动不一定导致细胞死亡，不完全MOMP（iMOMP）提供了完整线粒体，能够抵抗细胞死亡。对此现象，研究团队展开了深入的探索。
中国与法国的关系1. BH3类似物诱导产生持久性癌细胞
作者使用BH3类似物ABT-737和S63845（S6）处理野生型（WT）、双敲DKO（BAX和BAK）和三敲TKO（BAX、BAK和BOK）细胞，通过活细胞量化实验确定了BH3类似物的最大靶向剂量（图1 A）。通过BH3类似物处理后不同时间的药物敏感性对比，证明细胞耐受的持续状态是短暂的（图1 B）。
随后作者在体内检测亲代细胞（PT）和持久性细胞（PS）的表现。首先使用BH3类似物刺激人结肠癌细胞HCT116产生PC9持久性细胞，然后通过NSG小鼠的尾静脉注射，比较未处理PT和PS的肺定殖能力，发现肺定殖主要由PS产生而非PT（图1 C）。同样，尾静脉注射荧光素标记细胞的活体检测显示，PS注射后的小鼠肿瘤负荷明显高于PT（图1 D-E）。
为了更好的体内验证效果，作者设计了肺肿瘤的活体原位模型。通过不同染料标记的PS和PT注入受体动物的左肺（图1 F）。结果证明体内PS的增殖效率和侵入性都高于PT（图1 F-G）。
那使用BH3类似物产生的PS是否会导致对其他癌症疗法的交叉耐药呢？作者发现使用不同的癌症药物处理PS的活性均明显增加脉管舒（图1 H）。
PS的表型特征之一是依赖于脂质过氧化物酶GPX4。作者也使用GPX4抑制剂RSL3验证了PS对GPX4的依赖性（图1 I）。
为了获得不同方法产生的PS共同特征，作者进一步使用RNA-seq分析这些细胞的共同基因表达特征，发现了转移与侵袭、细胞应激反应、上调的炎症信号和EMT、下调的脂肪酸代谢、氧化磷酸化和mTORC1信号（图1 J）。因此，使用BH3类似物生成的PS和在不同条件下产生的耐药PS具有相同的基因表达和表型特征。
北极光俄语图1 靶向抗凋亡蛋白Bcl-2诱导持久性细胞
2. 持久表型主要取决于Bcl-2效应蛋白
BH3类似物能够将BCL-2效应蛋白与抗凋亡蛋白解离并引起MOMP。为了确定BCL-2效应蛋白对持久表型的重要性，将BAX、BAK和BOK敲除的细胞（TKO）和WT细胞进行比较。实验证明PS的肺定殖能力（图2 A）及其转移潜能（图2 B）取决于BCL2效应蛋白。此外，BH3类似物处理前后的TKO细胞对RSL3诱导铁死亡的敏感性相同（图2 C）。
为了出可能参与持久性表型的下游通路，作者将对照组（MOCK）或BH3模拟物处理的
WT和TKO细胞进行了RNA-seq。BAX-、BAK-、BOK-依赖性差异表达基因（DEGs）的富集分析证实了这些通路对BCL-2效应蛋白的依赖（图2 D），如NF-kB信号通路和EMT上调、mTORC1信号通路和脂肪酸代谢下调，另外也发现了其他通路变化包括白介素信号转导和“EIF2AK1（HRI）对血红素缺乏的反应”（图2 E-F）。有趣的是许多DEGs已证实与转移、血管生成和癌症免疫逃避有关（图2 G）。
wits进一步对EMT和细胞周期通路的前10个变化的DEGs进行分析，出与持久表型相关的潜在基因（图2 H）。在GSH代谢途径中下调的DEGs只在WT PS中发现，TKO细胞未发现（图2 I）。
图2 持久性表型很大程度上依赖于Bcl-2效应蛋白
3. 转录组分析显示在BH3类似物持久性细胞中存在短暂的ISR表达谱
为了进一步了解持久性表型的产生机制，作者对BH3类似物处理后1、3和7天后的PS（分别为PS1D、PS3D和PS7D）和相应的PT进行了单细胞RNA-seq。UMAP（均匀流形近似与投影）分析揭示PS在BH3类似物处理时间越长，表型趋势越接近PT（图3 A）。有趣的
是，拟时序分析中较早激活的基因簇显著富集在EMT通路和综合应激反应（ISR）中（图3 B-C）。
相反，后期的基因簇（2和4）则富集了与DNA复制和细胞周期进程相关基因，两者都是后期PS和PT的标志。PS1D中的ISR相关基因上调在随后几天逐渐回落（图3 D），也符合PS持久表型的短暂性。
图3 转录组分析显示在BH3类似物持久性基因中存在短暂的ISR表达谱
4. BH3类似物诱导BCL-2效应子依赖性ISR，独立于caspase激活
ISR是否与MOMP和持久性表型有关是作者接下来的方向。已有研究显示ISR的触发依赖于控制蛋白翻译起始因子eIF2α的磷酸化，四种激酶（EIF2AK1/HRI、EIF2AK2/PKR、EIF2AK3/PERK和EIF2AK4/GCN2）响应不同的上游刺激，启动翻译重编程。在这其中激活转录因子4（ATF4）能够在短期内激活相关基因表达通过增加营养吸收、自噬和抑制氧化应激来促进生存。
在BH3类似物处理1小时后观察到eIF2⍺的磷酸化和ATF4的表达上调，该结果与转录学结果
一致证实ISR参与了该过程（图4 A）。共聚焦成像也证明PS比PT的核ATF4蛋白表达水平更高（图4 B-D）。
此外作者通过设计ATF4翻译报告器明确了BH3类似物诱导的PS会刺激ATF4表达上调，同时TKO细胞则并没有检测到信号（图4 E-F）。
为了了解caspase激活是否与ATF4激活相关，作者使用BH3类似物处理Casp9敲除细胞。这类细胞不能激活caspase级联反应，但是在处理后仍然能检测到ATF4的信号（图4 G）。
凋亡酶激活因子APAF1敲除细胞和casp9敲除细胞都能在BH3类似物处理后检测到ATF4的表达（图4 H）。Pan-caspase抑制剂Q-VD-OPh处理的细胞也能检测到（图4 I）。表明ATF4的激活独立于caspase激活。
最后作者还发现eIF2⍺激酶中HRI（EIF2AK1）负责eIF2⍺磷酸化和ATF4翻译（图4 J-K）。因此，BH3类似物通过HRI诱导ISR，这一过程依赖于BCL-2效应器（BAX、BAK和BOK），但不依赖于caspase激活。
图4 BH3类似物诱导BCL-2效应子依赖性ISR，独立于caspase激活
5. 亚致死性MOMP对ISR的激活至关重要
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