结直肠癌（CRC）是世界范围内第三大致死癌症，由于其侵袭性强、预后差和缺乏靶向，因此发病率较高。基于5-氟尿嘧啶（5-FU）的化疗在CRC的中起了重要作用。然而，由于长期使用5-FU会产生多药耐药性（MDR），从而严重削弱了效果[1, 2]。
最近，科学家们发现癌症耐药株中miRNA在耐药性方面起了重要作用，且药物抗性的分子靶点和机制也被阐明[3, 4]，如miR-21可通过下调CRC中人类DNA MutS homolog2（hMSH2）诱导对5-FU的耐药性[5]。文献进一步报道，恢复失调的miRNAs可以有效克服耐药性。因此，作者推测共传递MDR-reversing miRNA和化学药物将是一种有望克服癌症化疗中MDR的有效方法。但是，安全有效的靶向给药系统是CRC的关键。 外泌体（exosomes）是由多泡体（MVB）与质膜融合时释放到细胞外环境的一种膜泡[6]，在不同细胞的外泌体中都可以检测到mRNAs、miRNAs和蛋白质的存在，以此挖掘外泌体介导细胞间通讯的潜在机制。文献报道了外泌体可以有效地传递生物药物，且通过分子途径可以靶向识别肿瘤细胞，实现精准药物递送[7]。但是利用外泌体进行功能RNAs和化疗药物共递送尚未被分析透彻，还需要进一步研究。 近期东南大学肖忠党课题组通过对外泌体进行改造，同时用外泌体共递送5-FU和miR-21抑制剂（miR-21i）靶向结肠癌细胞，经体外和体内研究表明了用工程化外泌体递送5-FU和miR-21i可有效逆转耐药性，并显著增强了5-FU耐药癌细胞的毒性[8]。
和元生物可提供从实验设计、外泌体分离、外泌体鉴定、外泌体高通量检测、外泌体示踪到体内外功能验证的整体服务。
实验结果：
1.外泌体的分离和表征
为了使外泌体具有靶向性，作者将Her2亲合体与人Lamp2的胞外N端融合，根据以前的研究，Lamp2蛋白在外泌体膜中被大量发现。再将该融合结构克隆到带有GFP的慢病毒载体中，形成了THLG，另外一种不含Her2亲合体的融合结构，克隆后形成了LG，作为对照（Fig.1a）。随后将THLG和LG转染到HEK293T中，THLG-293T或LG-293T细胞的荧光显微镜图片显示，THLG和LG嵌合体蛋白存在于颗粒膜和质膜中（Fig.1b）。从THLG-293T或LG-293T的培养上清中分别超离出外泌体（THLG-EXO 和LG-EXO），再用western对
外泌体的标志物如CD63、CD9、CD81进行检测（Fig.1c）。为了验证LAMP2融合蛋白是否结合到来自母细胞的外泌体中，作者用anti-GFP抗体和WB检测了融合蛋白在母细胞和外泌体中的表达。如Fig.1c所示，融合蛋白（LG）的分子量大约在80kDa，而THLG融合蛋白略高于LG，这与糖基化LAMP2和GFP的分子大小之和一致。此外，结果显示LG和THLG在HEK293T中均有高表达，并能整合到外泌体中。相比之下，在转染GFP的HEK293T细胞的外泌体中没有检测到GFP的水平，说明细胞质中的GFP可能没有整合到外泌体（Fig.1d）。此外，上述结果证明了含有GFP的融合蛋白存在于外泌体中，并对THLG-EXO和LG-EXO进行检测，结果显示可以在激光扫描共聚焦纤维镜下观察到GFP。这一结果进一步表明了融合蛋白成功地整合到外泌体中（Fig.1e）。
然后利用透射电镜（TEM）和动态激光散射光谱（DLS）对外泌体的形态和大小进行了评价。其中，THLG-EXO具有典型的碟状双层膜结构，直径为60-130nm（Fig.1f）。DLS结果显示外泌体的大小分布较窄，平均直径为97nm，而THLG-EXO在装载了5-Fu/miR-21i后大小为110nm（Fig.1g）。
Fig.1 工程化外泌体的分离和分子特征
2.含miR21i和5FU外泌体的制备
接下来，作者评估了THLG-EXO作为共递送5-FU和miR21i的载体的可行性。之前的一些结果表明，使用电穿孔可以有效地将化疗药物和外源短RNAs引入EVs。在本次研究中，作者也使用了电穿孔的方法将miR21i和5FU装载入外泌体中。为了获得最佳的电穿孔参数，作者测试了不同的电压和脉冲长度对电穿孔效率的影响。结果表明，当时间常数为10ms，电压为1000V时，装载效率最高。电穿孔后，THLG-EXO/5-FU/miR-21i的体积在miR-21i和5-FU负载的外泌体的形态上显示出一些细微的差异，包括略大的平均直径（110±11.3nm）(Fig. 1f, g)和表面电位（11±2.7mV）。而TEM照片显示THLG-EXO的平均直径为97±6.2 nm，表面电位为甬台温铁路亲水铝箔−8±2.4 mV。关于这些变化，作者推测这是在外泌体中电穿孔miR-21i和5-FU的结果，因为所有用于产生外泌体的其他程序都是相同的。在最佳电穿孔条件下，HPLC和qRT-PCR结果表明，外泌体的5-FU和miR-21i负载量（LC）分别约为3.1%和0.5%。
3.THLG-EXO的体外靶向性
为了分析THLG-EXO在体外的潜在靶向能力，作者建立了Her2阴性的SGC-7901 WT细胞
和Her阳性的Her2-mcherry-SGC-7901细胞共培养模型并进行了评价(Fig. 2a)。荧光显微镜结果显示，与SGC-7901 WT细胞相比，THLG-EXO与Her2-mcherry-SGC-7901细胞共培养3h后，THLG-EXO能更有效地进入Her2-mcherry-SGC-7901细胞。相比之下，LG-EXO在Her2-mcherry-SGC-7901细胞中没有表现出这种特异性的定位，且在共培养模型中随机分布(Fig. 2b)。此外，利用流式细胞仪定量分析了THLG-EXO的细胞摄取情况。图Fig. 2c所示，与THLG-EXO共培养3h后，GFP阳性的Her2-mcherry-SGC-7901细胞增加了92.9%，而SGC-7901细胞则为18.6%，差异具有统计学意义（p<0.01）。相比之下，与LG-EXO共培养3h后，GFP阳性的Her2-mcherry-SGC-7901细胞百分比仅增长了1.4%，而SGC-7901细胞比例为1.2%。这些结果表明使用T-Her2作为Her2的配体可以显著地增强外泌体靶向细胞的能力。曾凡亚
Fig.2THLG-EXO在体外的细胞趋向性
4.THLGEXO/5FU/miR21i的体外抗肿瘤作用
上述结果表明，工程化外泌体能有效地被受体细胞吸收。随后，作者研究了包裹了miR-21i和5-FU的THLGEXO诱导的生物学效应以及miR-21i和5-FU对5-FU耐药的结肠癌细胞系的
索拉非尼协同细胞毒性。HCT-116的5-FU耐药株是在5-FU浓度逐渐增加的情况下，由这些细胞连续传代产生的。首先，作者研究了THLGEXO/5FU/miR21i传递寡核苷酸进入靶细胞的能力。如Fig.3a所示，HCT-1165FR与THLGEXO/miR21i共孵育6h后，其内源性miR-21水平显著降低，而与游离的miR21i共孵育后并没有出现这种情况，说明与游离的miR-21i共孵育后并没有寡核苷酸进入HCT-1165FR细胞。为了进一步证实THLGEXO/5FU/miR21i中miR21i在HCT-116蔡澜食材字典5FR细胞中诱导的生物学功能，作者评估了miR-21下游靶基因的表达水平，如hMSH2和PTEN。如所预期的，与THLG-EXO处理的细胞相比，HCT-1165FR细胞用THLG-EXO/5-FU/miR-21i处理后，hMSH2和PTEN的蛋白表达水平增加（Fig.3b）。这些结果表明THLGEXO/5FU/miR21i可以有效地将miR-21i传递到受体细胞的细胞质中，且能特异性地沉默受体细胞中miR-21的生物学功能。
接下来，为了评估THLGEXO介导的5-FU和miR-21i共递送的协同抗肿瘤效果，作者研究了5-FU浓度为5ug/ml时HCT-1165FR细胞的凋亡、细胞周期和增殖情况。如Fig.3c所示，与装载了miR-21i或5-FU的THLGEXO共孵育后，HCT-1165FR细胞的凋亡率分别达到12.6%和26.2%。显然，与mock-THLG-EXO处理组相比，只递送miR-21i并不能达到理想的
效果。相比之下，THLG-EXO介导的5-FU和miR-21i共递送引起的细胞凋亡率（凋亡率约42.3%）要高于THLG-EXO/5-FU处理的细胞组（凋亡率约26.2%），这说明了协同效果对靶细胞的凋亡影响最强。
随后，通过PI对细胞周期进行评估，结果显示，与THLGEXO相比，THLGEXO/5FU/miR21i对HCT-1165FR细胞的S期阻断显著，而THLGEXO/miR21i对HCT-1165FR细胞周期分布没有明显的影响（Fig.3d）。值得注意的是，与THLGEXO相比，THLGEXO/5FU/miR21i对HCT-1165FR细胞的G1期也有一定程度的影响，但是这种效果没有对S期明显。此外，作者还分析了THLGEXO/miR21i、THLGEXO/5FU、THLGEXO/5FU/miR21i抑制癌细胞增殖的能力。结果显示，这三种外泌体都可以抑制细胞的增殖，但是随时时间的推移，它们对细胞增殖的影响有明显的差异。如Fig.3e所示，与THLGEXO/miR21i、THLGEXO/5FU、THLGEXO/5FU/miR21i共培养6天后，细胞增殖分别被抑制了约12%、43%和82%。这个结果表明，虽然THLGEXO/5FU具有较强的抑制生长的作用，但是THLGEXO/5FU/miR21i对细胞增殖的抑制作用更强，几乎完全抑制了细胞的增殖。而用THLGEXO/miR21i处理的细胞增殖略有下降。这与作者在细胞周期阻断和凋
亡结果上的发现一致。因此，研究结果揭示了miR21i可以提高HCT-1165FR细胞对5-FU的敏感性，并且与单药剂相比，5-FU与miR-21i联合可以显著提高5-FU对HCT-1165FR细胞的抗肿瘤作用。
Fig.3 用THLGEXO/5FU/miR21i体外处理HCT-1165FR细胞的结果
装煤机
5.THLGEXO在体内的分布情况
THLGEXO介导的miR21i和5FU对Her2阳性癌细胞的共递送已显示理想的体外递送效果。随后，作者用体内成像系统评估其体内递送效率。为了阐述体内靶向肿瘤的能力，作者在BALB/c雌性裸鼠的皮下接种了HCT-1165FR细胞。之后，用DiR染料标记THLGEXO和LGEXO，经尾静脉注射入裸鼠体内。在不同的时间点监测注射的外泌体的生物分布情况。如Fig.4所示，在注射后的最早时间点（30min），THLGEXO和LGEXO迅速分布全身，不同的是，THLGEXO在肿瘤内分布比较多，说明THLGEXO在肿瘤区域内能快速积累，而LGEXO主要分布在肝脏，这表明了LGEXO吸收和保留主要发生在肝脏和其他代谢器官，没有在肿瘤区域积累。此外，随着时间的推移，在这两组之间发现了显著的差异。在注射
THLGEXO 3小时后，肿瘤区域能检测到较强的荧光信号，而小鼠身体其他部位的英冠光信号逐渐减弱。此外，在注射LGEXO 6小时后，足部和颈部仍可检测到相对强烈的荧光信号。相比之下，THLGEXO组在这些部位没有检测到信号，而荧光信号仅在肿瘤部位检测到了。综上所述，这些数据表明THLGEXO可以作为靶向Her2表达肿瘤细胞的有效药物载体。
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