慢病毒侵染及分子克隆最全知识讲解，学习这一篇就够了！ 一、慢病毒基础简介
国家安全委员会成员
二、慢病毒体外包装
三、慢病毒体外侵染
四、慢病毒滴度测定
五、慢病毒体内侵染
六、慢病毒质粒构建
一、慢病毒基础简介
简介：消防指挥官
1.慢病毒是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因载体； 2. 逆转录病毒载体；
4. 在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细
胞等多种类型的细胞。
形态结构：
侵染过程：
二、慢病毒体外包装
1.人工体外包装生产慢病毒
慢病毒包装的条件：
①包装细胞（HEK293T)
②辅助质粒（RRE , REV, Vsvg)
④转染
①试剂：
1）包装细胞（HEK293T)
2）辅助质粒（RRE , REV, Vsvg)
3）携带GFP基因CDNA的质粒（Fugw-GFP, Plx304)
4）脂质体转染
②步骤：
1)传代293T细胞；
2)24h 后，取1.5 ml EP管，加入OPTI-MED，加入RRE , REV, Vsvg，加入携带表达目的基因的
Fugw-GFP质粒，混匀，加入脂质体，吹打混匀；
3）静止30min，加入到HEK293T 细胞，等待48 h；
4）收集上清即为慢病毒。
3.干扰目的基因表达的慢病毒包装
①试剂：
1）包装细胞（HEK293T)
2）辅助质粒（RRE , REV, Vsvg)
3）携带干扰目的基因表达的shRNA的质粒（Fugw, PLKO.1)
4）脂质体转染
②步骤：
1）传代293T细胞；
2）24h 后，取1.5 ml EP管，加入OPTI-MED，加入RRE , REV, Vsvg，加入携带干扰目的基因表达的质粒PLKO.1 ，混匀，加入脂质体，吹打混匀；
3)静止30min，加入到HEK293T 细胞，等待48 h；
4）收集上清即为慢病毒。
三、慢病毒体外侵染
1.慢病毒体外侵染步骤：
①细胞培养箱取出细胞到无菌操作台；
②取慢病毒上清直接加入到目的细胞的培养基中，轻轻摇晃；
③把细胞放回培养箱，放置2-4 天。
2.慢病毒体外过表达侵染：
3.慢病毒体外干扰基因表达侵染：
四、慢病毒滴度测定
1.滴度：指每毫升中含有的具有的病毒颗粒数
慢病毒浓缩
浓缩方法:
①超高速离心；
②PEG8000沉淀；
③超过滤。
2.滴度（Titer) 检测
①定量 PCR 法:
QuickTiter™慢病毒滴度试剂盒，检测到的是总的慢病毒颗粒数目
② OD值：
分光光度计测OD ，检测到的是总的慢病毒颗粒数；
③稀释侵染:
稀释慢病毒颗粒，侵染HEK293细胞，荧光成像分析或流失分析，检测到的是具有生物活性的慢病毒颗粒数（TU/ML)。
五、慢病毒体内侵染
1992年，慢病毒立体注射，首次成功侵染体内细胞成功表达目的基因。
GFP慢病毒立体注射刚出生小鼠，14天后GFP在体内神经元达。
GFP腺病毒立体注射小鼠，大面积表达GFP蛋白。考古墓地
六、慢病毒质粒构建
1.分子克隆
①目的基因扩增
②质粒载体双酶切
③目的基因及载体连接和转化
④质粒测序及表达鉴定铁道学报
2.目的基因扩增（PCR ）
模板，引物，高保真酶体外扩增目的基因片段
中国铝业中州分公司
3.限制性内切酶酶切
4.电泳和胶回收
5.连接
①酶切后的载体与酶切后的目的基因进行连接
②酶切后的载体与酶切后的目的基因进行连接步骤
6.转化
① Add 5 ul production into competence for 30 min
② 42 ℃ heat shock 45 s
③ Put into ice 2 min
④ Recovery 45 min
⑤ Plating in Ampicillin plate
7.菌落生长
连接成功后，载体是环状，可以表达抗氨苄基因，可以在氨苄的培养基板上生长。
8.阳性菌落鉴定
设计引物，挑选菌落，菌落PCR鉴定阳性克隆菌落。
9.阳性克隆测序鉴定
10.阳性克隆测序与目的基因序列比对沈氏家族
11.阳性质粒表达鉴定
将构建成功的质粒，转染到HEK293细胞，提取蛋白，WB检测目的基因表达。
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