在生理条件下，细胞自噬活性通常较低。但在饥饿、缺氧和疾病等刺激下会显著上调。另外，自噬抑制也与某些疾病相关，如癌症、神经退行性疾病等。选择理想的检测方法对于自噬研究至关重要。常用的观察和检测方法有∶ 1透射电镜法
自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。
自噬标志 | 形态学特征 | 自噬阶段 |
贾大山 取经隔离膜 | 新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势 | 自噬初期 |
自噬小体 | 双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等 | 自噬中期 |
| 杜培武单层膜，胞浆成分已降解 长春中医药大学学报 | 自噬后期 |
| | |
债权人权益表1. 自噬各阶段的形态学特征
图5. 透射电镜下自噬小体（单箭头）和自噬溶酶体（双箭头）形态（稀油站Noboru, Mizushima et al. Cell, 2010）2荧光显微镜观察法 LC3全称MAP1LC3 ，贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。哺乳动物的LC3可分为三种：LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B应用广泛。
LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸残基，产生胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）相偶联，形成LC3-II并定位于自噬体内外膜上。自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产生LC3-I循环利用；内膜上的LC3-II被溶酶体酶降解，导致自噬溶酶体中LC3含量很低（图6）。因此，可以通过荧光显微镜观察内源性LC3或GFP-LC3，实现对自噬发生的检测。 图6. LC3在自噬发生中的路径
(Kiriyama Y et al. International Electronic Conference on Medicinal Chemistry, 2016)GFP-LC3单荧光和mCherry-GFP-LC3双荧光指示系统
自噬形成时，GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3融合蛋白转移至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿或黄荧光斑点。当自噬溶酶体形成后，酸性环境使GFP荧光淬灭，而mCherry荧光不受影响，自噬溶酶体呈现红荧光（图7）。因此，可以通过LC3荧光指示系统来监测自噬流。
山西省人事厅网
图7. LC3自噬双标系统追踪自噬流不同阶段（Hansen T E, Johansen T. BMC Biology, 2011）3Western Blot检测LC3和p62蛋白的表达量
① 利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化评价自噬形成（图8）。自噬形成时，胞浆型LC3-I会酶解掉一小段多肽，随后跟PE结合转变为膜型的LC3-II。因此可以通过LC3-II/I比值的大小估计自噬水平的高低。
图8. WB检测自噬通量示意图
（Yoshii, S.R. and N. Mizushima. Int J Mol Sci, 2017）
② 除LC3外，其他自噬底物表达量的变化也可以用于监测自噬流。其中，p62是研究广泛
的一个自噬底物。在自噬体形成过程中，p62作为链接LC3和聚泛素化蛋白之间的桥梁，被选择性地包裹进自噬体，之后被自噬溶酶体中的蛋白水解酶将其降解（图9），所以p62蛋白的表达量与自噬活性呈现负相关。因此，利用Western Blot检测p62蛋白的表达量也可以评价自噬水平。
图9. p62介导的选择性自噬模型
（Ichimura Y et al. J Biol Chem, 2008）4基于Keima蛋白的自噬评价
Keima是一种pH敏感型荧光蛋白，利用它在中性和酸性pH中荧光信号不同的特性，可以直
观地反映自噬程度。将细胞质的Keima传递到溶酶体可反映非选择性自噬，将Keima融合到特定的蛋白(如融合到线粒体靶向序列—mt-Keima)可用于反映选择性自噬。值得注意是，基于keima的检测不能在固定细胞中进行，因为这种检测完全依赖于溶酶体的酸性。
图10. 基于Keima蛋白的自噬评价
（Yoshii, S.R. and N. Mizushima. Int J Mol Sci, 2017）
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议