扬州大学
硕士学位论文
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：预防兽医学
指导教师：***
20040501
、６２６９６３唐伟：基于基因免疫的绿荧光蛋白单克隆抗体制备与鉴定１
基于基因免疫的绿荧光蛋白单克隆抗体制备与鉴定
研究生：唐伟
导师：焦新安教授
摘要
近十年来绿荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）在分子生物学、细胞生
物学以及医药学等方面得到了广泛的应用，它是一类存在于水母、水螅和珊瑚等
腔肠动物体内的生物发光蛋白。因其荧光性质稳定，生团形成无需其它辅助因
子、甚至可用于活体检测等优点，ＧＦＰ作为一种新型免疫标记物逐渐取代了许多
钢筋混凝土结构预埋件其它常规荧光标记物。此外，ＧＦＰ还可以与目的蛋白融合而不改变目的蛋白的性
质和定位。但是在实际的应用中，也发现ＧＦＰ有一些有待克服的缺陷，如荧光有
时微弱、难以和背景区分、与ＧＦＰ融合表达的蛋白质提纯困难等。针对以上问
题，本文拟通过研制抗ＧＦＰ的单克隆抗体，为解决这些问题提供新型试剂。
针对原核表达ＧＦＰ作为免疫原制备单抗有一定困难的实际情况，本研究采用 基因免疫的方法制备单抗。实验中以表达ＧＦＰ的真核质粒ｐＶＡＸｌ一ＥＧＦＰ为免疫原，
建立了有效的免疫程序，并成功研制出ＧＦＰ的特异性单克隆抗体。真核质粒
ｐＶＡＸＩ—ＥＧＦＰ免疫程序大致步骤为：大提纯化质粒ｐＶＡＸｌ一ＥＧＦＰ，经琼脂糖电泳
和真核细胞（Ｐ８１５）转染试验鉴定后，经腿部双侧股四头肌注射免疫６周龄雌性
ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，每只小鼠质粒免疫剂量为１００１．ｔｇ，三周后同法进行第二次免疫，六
周后第三次免疫，第九周加强免疫，加强免疫后一周采血测血清ＥＬＩＳＡ抗体效价，
同时取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞Ｓｐ２／０一Ａｇ一１４进行融合。以间接ＥＬＩＳＡ试验
进行筛选，筛选出阳性克隆，并经有限稀释法三次亚克隆之后，共获得四株稳定
分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为１Ａ１２，３Ｃ８，３Ｄ６，４Ｄ９。对
扫描电镜与透射电镜单抗的特异性鉴定结果表明，杂交瘤培养上清的间接ＥＬＩＳＡ效价分别为１：３２００、
１：１６００、１：３２００、１：２５６０，腹水效价为１：５００００、ｌ：１３０００、１：４００００、１：２５０００。四株
单抗的免疫球蛋白亚类均为ＩｇＧｌ。在Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ试验中四株单抗均与原核表达ＧＦＰ
的菌株反应，而对其它菌株不反应。经过Ｗｅｓｔｅｒｎ＿ｂｌｏｔ分析，四株单抗均与２７ＫＤ
塑型盔兰堡主兰焦堡奎！条带处的ＧＦＰ反应，而不与其它条带反应，进一步证明此四株单抗为针对ＧＦＰ的特异性单抗。
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ＧＦＰ单克隆抗体可扩大ＧＦＰ检测的灵敏度，拓展ＧＦＰ的应用范围，预计ＧＦＰ单抗在抗原定位、融合蛋白纯化、病原体与宿主之间相互作用研究以及新型诊断试剂研制等方面具有重要用途。
关键词：绿荧光蛋白；基因免疫；单克隆抗体
唐伟：基于基因免疫的绿荧光蛋白单克隆抗体制备与鉴定
中国医学ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎＢａｓｅｄ
鼻渊散
ｏｎＧｅｎｅｔｉｃＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ
Ｍ．Ｓ．ｃａｎｄｉｄａｔｅ：ＷｅｉＴａｎｇ
Ａｄｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＸｉｎａｎＪｉａｏ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｉｎｔｈｅｌａｓｔ１０ｙｅａｒｓｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）ｈａｓｃｈａｎｇｅｄｆｒｏｍａｎｅａｒｌｙｕｎｋｎｏｗｎｐｒｏｔｅｉｎｔｏａｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｔｏｏｌｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｎｄｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ．ＧＦＰｉｓｍａｉｎｌｙｃｏｍｅｆｒｏｍｊｅｌｌｙｆｉｓｈ，ｈｙｄｒａａｎｄｃｏｒａｌｔｈａｔｂｅｌｏｎｇｔｏｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｔｅ．Ｉｔｉｓｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙｕｓｅｆｕｌｄｕｅｔｏｉｔｓｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｔｈｅｆａｃｔｔｈａｔｉｔｓｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｉｓｆｏｒｍｅｄｉｎａｎａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎｔｈａｔｄｏｅｓｎｏｔｒｅｑｕｉｒｅａｎｙｃｏｆａｃｔｏｒ．ＴｈｉｓｈａｓｅｎａｂｌｅｄｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｔｏｕｓｅＧＦＰｉｎｌｉｖｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄｉｔｈａｓｌｅｄｔｏｉｔ’ｓｗｉｄｅｓｐｒｅａｄＵＳｅａｓａｍａｒｋｅｒｉｎｔｈｅｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｆｉｅｌｄ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｉｔａｐｐｅａｒｓｔｈａｔｆｕｓｉｏｎｏｆＧＦＰｔｏａｐｒｏｔｅｉｎｄｏｅｓｎｏｔａｌｔｅｒｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｒｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｉｓｈｉｎｄｒａｎｃｅｉｕｓｏｍｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｉｅｌｄｓ：ＧＦＰ’
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ｍｙｅｌｏｍａｃｅｌｌｓ，ａｎｄｔｈｅｐｏｓＲｉｖｅｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙ
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扬州大学硕士学位论文４ｔｉｔｅｒｓｏｆｔｈｅｉｒｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓｗｅｒｅ１：３２００、１：１６００、１：３２００、１：２５６０ａｎｄａｓｃｉｔｉｃｆｌｕｉｄｓｗｅＦｅ１：５００００、１：１３０００、１：４００００、１：２５０００ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓｕｂｃｌａｓｓｏｆｔｈｅ４ｍＡｂｓｗｅｒｅＩｇＧｔ．ＩｎＤｏｔ－ＥＬＩＳＡ，ｆｏｕｒｍＡｂｓｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈｂａｃｔｅｒｉａｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＥＧＦＰ，ｔＩｌｅｙｄｉｄｎｏｔｒｅａｃｔｗｉｔｈｏｔｈｅｒｂａｃｔｅｒｉａｗｉｔｈｏｕｔＥＧＦＰ．ＴｈｅｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｆｏｕｒｍＡｂｓｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ２７ｋＤｐｒｏｔｅｉｎｏｆＥＧＦＰ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｆｏｕｒｍＡｂｓｗｅｒｅｓｐｅｃｉｆｉｃｔｏＥＧＦＰ．
ＧＦＰｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙＣａｎｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅＧＦＰｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｅｘｐａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＧＦＥＴｈｅＧＦＰｍＡｂｓｃｏｕｌｄｂｅｖｅｒｙｕｓｅｆｕｌｉｎｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｉｇｅｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｈｏｓｔａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎａｎｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｅｗｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ．
ＫｅｙＷｏｒｄｓ：ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ；ｇｅｎｅｔｉｃｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ
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