关于“亚细胞定位”伯⼩远在前⾯已经推出了好⼏期的⽂章，但仍有童鞋觉得不够，不够咋办呢？那就继续安排咯~谁让伯⼩远是个宠粉狂魔呢！ 亚细胞定位的重要性在前⾯的⽂章中已经讲过了，这⾥就不再多讲，我们只要记住，研究蛋⽩的亚细胞定位对于研究基因的功能、蛋⽩互作及其作⽤机理是⾮常有必要的就可以了。本期的⽂章不讲太多原理性的东西，主要为⼤家展⽰定位在不同的亚细胞结构的图⽚具体长什么样⼦，不要问伯⼩远为什么要⼤费精⼒去搜集这些东西，等你看完下⾯的内容就会明⽩，并且还会感谢伯⼩远哦！
1.研究亚细胞定位的⼀般⽅法
上位机软件
研究⼀个未知基因的蛋⽩亚细胞定位时，⼀般可以先⽤⽣物信息学的⽅法预测该基因的亚细胞定位（下表给出了⼀些预测亚细胞定位结果的⽹站（表1）），但绝⼤多数的预测程序算法是有⼀定局限的，其预测数据⼀般只能作为参考，具体的定位还得以实际的实验结果为准。
表1 蛋⽩质亚细胞定位的部分预测软件和⽹站(Donnes and Hoglund, 2004)。空间分布
⽬前植物蛋⽩质的亚细胞定位⽅法中应⽤较普遍的是借助于报告基因表达产物来实现⽬标蛋⽩定位的融合报告基因定位法，其中绿⾊荧光蛋⽩应⽤最为⼴泛。该⽅法⼀般需要借助⼀些已知定位的蛋⽩marker 作为参照，从⽽判断出未知基因的定位情况。那么蛋⽩marker怎么选？在实际的操作过程中⼀般先单独对⽬的基因进⾏预实验，根据预实验的结果判断其可能的定位，然后再选择对应的蛋⽩marker进⾏共转，进⼀步验证其亚细胞定位。单看这句话似乎很简单，但如果你对于不同的亚细胞结构长啥样都不清楚，⼜如何根据预实验结果选择对应的蛋⽩marker呢？为了解决这个问题，伯⼩远先带你回顾⼀下基础的知识！
2.植物细胞结构
下⾯是⼀张植物细胞的亚显微结构图（图1），我们研究的⽬的基因可能定位在其中任何⼀个亚细胞结构上，因此先记清楚这些结构，然后和伯⼩远⼀起去⽂献⾥⾯看看定位在不同的亚细胞结构上的图⽚都长什么样吧！
图1 植物细胞的亚显微结构。
3.各亚细胞结构的定位情况
下⾯讲到的亚细胞定位，其⽤到的⽅法基本都是融合报告基因定位法，通过瞬转烟草叶⽚或原⽣质体在共聚焦显微镜下拍照观察到的结果。 3.1定位在细胞质
运筹与管理
我们⾸先看⼀看定位在细胞质具体长什么样⼦，下⾯是⼀篇⽂献，该⽂献讲到，在35S启动⼦的驱动下，将AtHSBP融合到GFP的N端（AtHSBP-GFP），并在野⽣型拟南芥叶⾁原⽣质体中进⾏分析，以评估热休克反应（HSR）期间的亚细胞定位情况（图2）。原⽣质体在不进⾏热休克（HS）处理（CK）的情况下，或在37℃时⽤HS处理1h（H1R0），然后从HS处理后恢复1h（H1R1）或2h（H1R2）以衰减热休克反应（HSR）。在正常情况下，AtHSBP-GFP主要在细胞质中（CK）中表达。⽽H1R0处理后，在细胞核内也可以观察到微弱的GFP信号。在H1R1恢复期间，AtHSBP-GFP 转移到细胞核中，然⽽，在H1R2恢复期间，⽆法检测到核定位的GFP信号。这些数据表明AtHSBP在热胁迫下可由细胞质定位易位到细胞核中。 河北体育学院学报图2 AtHSBP在拟南芥叶⾁原⽣质体中的瞬时表达(Hsu et al.,2010)。AtHSBP在叶⾁原⽣质体中的瞬时表达。⽤AtHSBP-GFP转染野⽣型拟南芥原⽣质体，不经HS（CK）或在37℃时HS处理1h（H1R0），从HS处理后恢复
1h（H1R1）或2h（H1R2）。⽤共聚焦显微镜观察GFP信号。蓝⾊表⽰4',6⼆脒基-2-苯吲哚盐酸（DAPI）染⾊的细胞核，红⾊表⽰叶绿体的⾃发荧光。
从这个例⼦我们可以看出，若⼀个基因定位在细胞质中，在⼀些情况下我们是可以看到布满整个原⽣质体的GFP信号的（如图2 CK，由于该⽬的基因并不定位在叶绿体中，因此存在⼀些被叶绿体遮挡的
空缺）；另外，由于植物细胞⼀般都存在⼤液泡，液泡的存在往往会将细胞质挤压到紧挨细胞膜的位置，这个时候我们并不能看到布满整个原⽣质体的GFP 信号，就⽐如下⾯这个例⼦（图3），35S驱动GFP在烟草原⽣质体中的瞬时表达，理论上应该是任何亚细胞器中都存在GFP信号，但是图3i中却存在很⼤⼀个空缺没有荧光信号，这个空缺的部分可能就是液泡，这个时候细胞质中的荧光信号就是紧挨细胞膜的，如果遇到这种情况，就需要通过marker来区分出到底是定位在细胞质还是定位在细胞膜中，⼜或者是细胞膜和细胞质中都有信号。
图3 35S-GFP在烟草原⽣质体中的表达(Liu et al., 2020)。
3.2定位在液泡
在⼀篇⽂献中，作者为了验证GmVTL1a的亚细胞定位，将GFP融合在基因的ORF的N端，并通过瞬时转化烟草原⽣质体进⾏观察，有趣的是，GFP蛋⽩的荧光信号仅在携带GFP-GmVTL1a转基因的烟草原⽣质体的液泡膜上观察到（图
4a-h），这很容易与叶绿体（ChlorophyII）、细胞膜标记物FM4-64FX的信号区分开来。
图4 GmVTL1a在烟草原⽣质体中的亚细胞定位(Liu et al., 2020)。（a，e）绿⾊表⽰GFP信号。（b）粉⾊表⽰叶绿体⾃⾝荧光。（f）红⾊表⽰细胞膜标记物FM4-64FX。（c，g）灰⾊显⽰明场。（d，h）合并后的图像显⽰了合并后的三个通道。
注：这⾥作者证明⽬的基因定位在液泡膜上并不是直接证明的，⽽是通过和细胞膜标记物FM4-64FX不重合间接证明的，⼤家在以后的学习中要是遇到不能直接证明的，也可以学习这种间接证明的⽅法哦！
3.3定位在叶绿体
上⾯的例⼦⽤到的⽅法都是瞬时转化原⽣质体对⽬的基因的亚细胞定位进⾏观察，并且都给出了叶绿体⾃发荧光的照⽚，想必⼤家都已经知道在原⽣质体中叶绿体长什么样⼦了，那么在烟草叶⽚中叶绿体会是什么样⼦呢？请跟伯⼩远⼀起看看下⾯的例⼦吧。从图5中可以看到⽤于检测PnToxA叶绿体定位的序列ToxA62-132融合GFP之后其亚细胞定位与叶绿体标记RUB1sp-mCherry的荧光在叠加图中完全重合，因此说明ToxA62-132-GFP定位在叶绿体中。
图5 ⽤于检测PnToxA叶绿体定位的序列的亚细胞定位(Sperschneider et al., 2017)。共聚焦图像显⽰了ToxA62-132-GFP在本⽒烟细胞中的叶绿体定位。左图显⽰叠加了ToxA62-132-GFP和RUB1sp-mCherry荧光的透射光图像。中间的图显⽰RUB1sp-mCherry荧光（叶绿体标记物），⽽右边的图显⽰ToxA62-132-GFP荧光。
如果我们观察到的荧光呈点状，并且与叶绿体的marker重合，那么我们可以考虑⼀下其亚细胞定位是否定位在内囊体或者质体上（图6）。
图6 表达PGTG_00164-YFP（a）或PGTG_06076-YFP（b）的细胞显⽰叶绿体点状定位，提⽰其定位可能是类囊体或质体(Sperschneider et al., 2017)。
3.4定位在内质⽹
内质⽹，光听这个名字就知道其形状应该和“⽹”脱不了关系，通过实验证实定位在内质⽹中的形状确实也都是⽹状的，下⾯给出了两个在烟草叶⽚细胞中定位在内质⽹中的图⽚（图7，图8）。
图7 拟南芥细胞分裂素受体AHK3定位于瞬时转化的烟草叶⽚细胞和拟南芥幼苗的内质⽹(Caesar et al., 2011)。（A-D）35S启动⼦或UBQ10启动⼦驱动AHK3与内质⽹标记ER-rk CD3-959的烟草叶表⽪细胞中共表达的共聚焦图像。
图8 RTP1-GFP的亚细胞定位。RTP1-GFP或Free-GFP在烟草叶⽚中瞬时表达，并在共聚焦显微镜下观察荧光。RTP1:GFP融合蛋⽩定位于烟草表⽪细胞的内质⽹（ER）。Free GFP作为对照。ER标记为红⾊荧光，GFP荧光为绿⾊。Overlay是绿⾊荧光和红⾊荧光的叠加图。
⾊。Overlay是绿⾊荧光和红⾊荧光的叠加图。
3.5定位在细胞核
我们都知道转录因⼦⼀般定位在细胞核中，下⾯这个例⼦就是参与拟南芥防御信号通路的关键转录因⼦AtWRKY29，在⼀种南极开花植物南极漆姑草原⽣质体中的亚细胞定位情况，可以看出其亚细胞定位仅定位于细胞核中（图9b）。
图9 AtWRKY29在南极漆姑草原⽣质体中的亚细胞定位(Cha et al., 2019)。（a）35-GFP；（b）AtWRKY29-GFP。3.6定位在核膜
一个粗瓷大碗课文教案定位在核膜，植物中我们⼀般⽐较少见，⽽⼈类的许多罕见疾病，如肌⾁萎缩、视神经萎缩和早衰症，都与核膜成分的突变密切相关，植物在核膜这⼀⽅⾯研究的⽐较少，今天我们就只看看定位在核膜上的亚细胞定位图⽚。下⾯的基因PNET7就是定位在核膜上的⼀个例⼦（图10）。
图10 YFP标记的PNET7在烟草叶⽚中瞬时表达的亚细胞定位结果(Tang et al., 2020)。红⾊荧光代表细胞核。
3.7定位在核仁
很多时候我们都只关注⼀个基因是否定位于细胞核，没想到下⾯这个例⼦还专门把核仁单独拿出来研究了，其中PGTG_13278-YFP虽然定位于细胞核，但并不定位于细胞核中的核仁，⽽PGTG_15899-YFP不仅定位于细胞核也定位于核仁中，⾄于为什么，⼤家如果感兴趣，可以去看⼀下这篇⽂献喔！
图11 表达PGTG_13278-YFP的细胞表现为细胞核定位但排除核仁（a），表达PGTG_15899-YFP的细胞表现为细胞核和核仁定位（b）(Sperschneider et al., 2017)。
3.8多种亚细胞结构定位集锦
剩下的细胞器有⼀篇⽂献做的很全⾯，作者将⼀些细胞器的marker分别在⽔稻原⽣质体以及稳转⽔稻的叶⽚和根中进⾏了观察，因此这⾥就不再像上⾯⼀样详细地介绍了，⼤家可以看看下⾯两张图，⼀些还没来得及介绍的细胞器基本都在⾥⾯，其中也包括⼀些上⾯已经介绍过的，但不妨碍⼤家再看⼀遍，因为有时候⽤到的转化受体不⼀样，其形态可能也存在差异，好了，我们⼀起去看看吧！
图12 绿⾊荧光蛋⽩（GFP）和GFP融合细胞器标记物在⽔稻原⽣质体中的亚细胞定位(Wu et al., 2015)。（A）GFP在细胞质中的表达。（B）内质⽹（ER）标记SPAmy8-GFP-KDEL。（C）线粒体标记NRPS10-GFP。（D）质粒CD3-963包含⾼尔基体标记。（E）质粒CD3-971包含液泡标记。（F）细胞核标记OsRH36-GFP。（G）过氧化物酶体标记GFP-KSRM和（H）质膜标记OsRPK1-GFP。
图13 在转基因⽔稻植株中，针对不同细胞器的GFP或GFP融合细胞器标记物的亚细胞定位(Wu et al., 2015)。利⽤共聚焦显微镜在转基因⽔稻幼苗的叶⽚（左图）和根（右图）组织中显⽰GFP荧光。（A）GFP在细胞质中的表达。（B）内质⽹（ER）标记SPAmy8-GFP-KDEL。（C）线粒体标记NR
PS10-GFP。（D）质粒CD3-963包含⾼尔基体标记。（E）质粒CD3-971包含液泡标记。（F）细胞核标记OsRH36-GFP。（G）过氧化物酶体标记GFP-KSRM和（H）质膜标记OsRPK1-GFP。
3.9⼀些特殊的亚细胞结构定位
3.9.1定位在细胞⾻架
细胞⾻架⼀般是指细胞质中由蛋⽩质构成的纤维⽹格结构。它是⼀个动态结构，其中有⼀部分不断的被破坏，更新或新建，有些细胞可以通过⾻架的破坏和重塑运动。下⾯给出了两个定位在细胞⾻架中的例⼦，不仔细看很容易与内质⽹的定位混淆，正好伯⼩远到了⼀个例⼦，同时给出了这两种亚细胞结构的定位情况，帮助你区分，真是贴⼼如我，哈哈！另外在其中⼀个例⼦中还给出了⼀些其它的细胞结构，买⼀送⼆，很赚有⽊有！
哈！另外在其中⼀个例⼦中还给出了⼀些其它的细胞结构，买⼀送⼆，很赚有⽊有！
下⾯给出的这个例⼦不仅给出了细胞⾻架的定位，还给出了肌动蛋⽩丝和微管的定位。⼤家可以⾃⼰对照区分⼀下哦！
图14 AtOFP1与细胞⾻架有关(Hackbusch et al.,2005)。利⽤激光共聚焦显微镜对瞬时表达的GFP融合蛋⽩在本⽒烟叶⽚中的定位进⾏了分析。（a）AtOFP1-GFP积聚在核仁中，且定位于细胞⾻架。（
b）肌动蛋⽩解聚药物cytochalasin D处理20分钟后，AtOFP1-GFP的定位没有改变。（c）Talin的I/LWEQ结构域融合GFP定位于肌动蛋⽩丝。
（d）MAP3-GFP与微管相关。
下⾯这个例⼦中的a（图15a）定位于内质⽹，b（图15b）则定位于细胞⾻架，两张图⽚都很清晰漂亮。根据图注⼤家可以发现这两个其实都是⼀个东西，⼤家有兴趣可以去研究⼀下这篇⽂献，这篇⽂献主要是关于亚细胞定位、⾮靶向运输以及胞间连丝之间的⼀些研究，这⾥就不详细解释了。
图15 TMV P30-rsGFP的靶向运输(Crawford et al., 2000)。P30-rsGFP定位于整个细胞和细胞壁的离散亚细胞位点。（a）共聚焦显微镜图像显⽰P30-rsGFP定位于内质⽹ER，（b）P30-rsGFP在细胞⾻架中的定位，（c）P30-rsGFP定位于转染细胞的细胞质，并位于移动的细胞的细胞壁上（斑点状）。（d）P30-rsGFP细胞聚焦，该蛋⽩主要定位于胞间连丝的细胞壁点状处。
3.9.2 定位于肌动蛋⽩丝
其实在上⾯的“买⼀送⼆”中已经看过肌动蛋⽩丝的定位了，这⾥伯⼩远还想给⼤家⼀个⾼清放⼤的图看⼀看（图16c），加深⼤家的印象！
图16 亚细胞定位决定了蛋⽩在胞间连丝运输中的可⽤性(Crawford et al., 2000)。（a）ER-GFP定位
于内质⽹腔，不能通过胞间连丝。（b）GFP-mTn定位于肌动蛋⽩丝，是细胞⾃主的。（c）转染GFP-mTn的细胞的⾼倍放⼤图，图中显⽰肌动蛋⽩丝。（d）NLS-rsGFP定位于细胞核，但也会转移到邻近细胞。转染后的细胞在细胞核、细胞膜和内质⽹ER 中均含有NLS-rsGFP，⽽在邻近细胞中仅在细胞核中检测到NLS-rsGFP。（e）NLS-rsGFP从转染细胞转⼊邻近的12个细胞。（f）NLS-2×rsGFP在转染细胞中保留。
3.10核糖体和细胞壁定位的问题
最后给⼤家解释⼀下为什么没有给出定位在核糖体和细胞壁的图⽚，原因是这两个亚细胞结构伯⼩远没有到⽐较好的相关⽂献，⼤家对这⽅⾯如果⽐较了解可以与伯⼩远互动哦！对于核糖体伯⼩远到很多核糖体蛋⽩相关的基因，作者研究的都是核糖体之外的功能，其定位有的在细胞核，有的在细胞质，伯⼩远猜想可能是核糖体的功能（合成蛋⽩质）已经很清楚了，所以⼤家研究的都是核糖体之外的功能；⽽对于细胞壁，⼀般是通过烟草叶⽚或者洋葱表⽪瞬时表达⽬的基因，通过质壁分离的⽅法来区分到底是定位在细胞膜还是细胞壁上。在这⾥伯⼩远分别了通过洋葱表⽪细胞和烟草叶⽚瞬时表达⽬的基因的例⼦，⽐较庆幸的是烟草叶⽚那个例⼦质壁分离之后在细胞壁上也有荧光，只不过是呈点状分布的，但是不管咋样伯⼩远还是到了，只是没有到那种完整定位于细胞壁上的例⼦！
在⼀篇⽂献中，作者⾸先证明了GTPases定位在细胞膜中，为了进⼀步验证GTPases的细胞膜定位，
作者在⾼浓度NaCl溶液处理下诱导表达GFP CA-OsRac3和GFP CA-OsRac6的洋葱表⽪细胞进⾏质壁分离。结果显⽰，在细胞质和细胞核中都发现了对照GFP（图17，左）。同样，GFP CA-OsRac6在细胞质、细胞核以及质壁分离后的细胞膜中均可见（图17，中间）。相反，GFP CA-OsRac3只在细胞膜中检测到，并且在质壁分离后随细胞膜收缩（图17，右）。
图17 0.5M NaCl溶液诱导洋葱表⽪细胞中瞬时表达的GFP-OsRac3（右）和GFP-OsRac6（中间）的质壁分离分析(Chen et al., 2010)。35S-GFP（左）作为对照。
这个例⼦作者利⽤农杆菌介导的瞬时检测⽅法确定RBSDV P7-1的亚细胞定位。在CaMV 35S启动⼦的控制下，P7-1融合到增强绿⾊荧光蛋⽩（eGFP）的N端，在本⽒烟草细胞中瞬时表达。注射后2天⽤共聚焦显微镜观察荧光。在表达
P7-1:eGFP的表⽪细胞中（图18A），细胞核、细胞质及细胞外周均有可见荧光，质浆裂解后的细胞沿细胞壁可见点状荧光。这种分布模式在表达对照35S:eGFP的细胞中没有发现，其中质膜荧光在质浆分解后从⾮荧光细胞壁分离出来。为了证实这⼀定位模式，作者将P7-1与黄⾊荧光蛋⽩的N端融合，在烟草的表⽪细胞中表达。如图18B所⽰，P7-1:YFP 在细胞核、细胞质和细胞外周均可见荧光，并在质壁分离后的叶⽚细胞沿细胞壁形成点状分布，⽽在表达35S:YFP的表⽪细胞细胞壁未见荧光。这些结果表明P7-1与细胞壁有关。
理查兹
⽪细胞细胞壁未见荧光。这些结果表明P7-1与细胞壁有关。
图18 P7-1在本⽒烟叶⽚细胞中的亚细胞定位。（A）35:eGFP（左）和P7-1:eGFP（右）在未质壁分离（上图）或质壁分离（下图）的本⽒烟叶⽚细胞中的定位。放⼤区域显⽰P7- 1:eGFP的点状结构。（B）35:YFP（左）和P7-1:YFP（右）在未质壁分离（上）或质壁分离（下）烟草叶⽚细胞中的定位。放⼤的区域显⽰了P7-1:YFP的点状结构。⽩⾊和⿊⾊箭头分别指向质壁分离后的细胞壁和质膜。
⼩远叨叨
看了以上不同基因定位在不同亚细胞器的荧光图⽚之后，想必⼤家对这些结构都有了⼀个⼤致的印象，有印象可不⾏，最好记住它们，这样当⾃⼰在研究⼀个新基因时，单独对新基因做完亚细胞定位的预实验之后，我们⼀定要尽可能准确地判断它的定位，然后选择合适的marker与其进⾏共定位，进⽽得到我们所要研究基因的亚细胞定位结果。再回到⽂章开头，⼤家是不是应该感谢⼀下伯⼩远呢！哈哈！最后，希望⼤家收藏本篇⽂章，没事拿出来多看⼀看，将这些不同的形状深深地刻在⾃⼰的脑海⾥，等到需要⽤的时候直接从⼤脑⾥⾯调取出来就可以啦！
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