生防菌哈茨木霉FJAT -9040的GFP 标记
肖荣凤
刘
波
*
史怀张衡宇朱育菁
（福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州350003）
摘要：哈茨木霉Trichoderma harzianum FJAT-9040对茄科尖孢镰刀菌具有较强拮抗作用。为跟踪分析该菌株在土壤中的存活与定殖特性，利用PEG-CaCl 2介导的原生质体转化体系，筛选获得1株荧光性状稳定的菌株FJAT-9295，该菌株在生长速率、产孢量、对酸碱度和温度的适应性及对尖孢镰刀菌的抑菌活性等方面与野生型菌株FJAT-9040无显著差异（P ＞0．05）。同时，研究了菌株FJAT-9295在4种类型土壤中的定殖能力以及作物生长对该菌株在土壤中定殖的影响。结果表 明：菌株在育苗土中定殖最好，其次为沙土及菜园土，黄泥土中定殖最差；种植茄子比未种植作物的土壤更有利于菌株的存活；菌株FJAT-9295在不同类型土壤中的菌落数随时间的延长均略有下降，16天后趋于稳定，维持在105CFU /g ，较初始接菌量下降了约1个数量级。关键词：哈茨木霉；绿荧光蛋白基因；土壤类型；定殖
Transformation of the biocontrol strain FJAT-9040of Trichoderma
harzianum with green fluorescent protein gene
and tracing its colonization in soils
Xiao Rongfeng
Liu Bo *
Shi Huai
Zhang Hengyu
Zhu Yujing
（Institute of Agrobiological Resources ，Fujian Academy of Agricultural
Sciences ，Fuzhou 350003，Fujian Province ，China ）
Abstract ：A biocontrol fungus FJAT-9040identified as Trichoderma harzianum ，was found to have high inhibition on mycelial growth of Fusarium oxysporum isolated from solanaceous crops．In order to visualize survivability and colonization of this biocontrol fungus in soils ，green fluorescence protein gene （gfp ）was transformed into the strain FJAT-9040using protoplast-mediated genetic transformation．A transformant ，FJAT-9295，with strong and stable expression of the fluorescent protein was chosen to compare their bio-logical characteristics with the wild type strain FJAT-9040．There were no significant differences between the transformant and the wild type strains in growth rate ，spore yield ，adaptability to culture pH or tem-peratures and antifungal activity （P ＞0．05）．The transformant FJAT-9295was then used to visualize its colonization in four types of soils and the effects of plants on its colonization．Among the four types of soils ，the best soil for colonization of the strain FJAT-9295was nursery soil ，the garden soil and sandy soil ranked second ，and the last one was loess soil．The population of strain FJAT-9295in the eggplant-grown soils was higher than that in the non-crop control soils．After mixed with soils ，the population of strain FJAT-9295decreased gradually compared with the initial inoculum in different types of soils ；howev
er ，
社会网络基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（200903049），福建省属公益项目（2010R1020-6），福建省杰出青年科学基金（2009J06010）作者简介：肖荣凤，女，1977年生，助理研究员，研究方向为生物防治，email ：xrfxiao@163．com *通讯作者（Author for correspondence ），email ：fzliubo@163．com 收稿日期：2011－06－04
第38卷第6期
2011年12月
植物保护学报ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA
Vol．38No．6Dec．
2011
DOI:10.13802/jki.zwbhxb.2011.06.004
they were stabilized with approximately105CFU/g after16days in the soils．
Key words：Trichoderma harzianum；green fluorescent protein gene；soil types；colonization
木霉Trichoderma对许多植物病原真菌具有很强的寄生或拮抗作用，如镰刀菌属Fusarium、疫霉属Phytophthora、核盘菌属Sclerotinia、丝核菌属Rhizoc-toniaand及腐霉菌属Pythium等的病原菌［1－2］。目前全球已有100多种含有木霉菌成分的生防制剂产品［3］，主要用于生物杀菌剂、土壤改良剂、作物重茬剂［2，4－5］，防治农作物土传细菌性和真菌性病害以及线虫病害等［6－7］。但是，生防制剂的应用一直面临效果不稳定的问题，木霉制剂的田间应用效果同样受自身和环境因素影响［8］。彭可为和李婵［9］研究指出，生防制剂迄今仍有两大难题：一是田间接种效果不稳定，且随土壤类型的不同有很大差异；二是所接菌株的存活量难以达到要求。也就是说，理论上生防菌要充分发挥生防作用，首先必须能够在特定的生态环境中生存；其次，生防菌还必须达到足够的数量级，对致病菌产生抑制作用，并适应在植物根系生存，最终达到生物防治的目的。目前，木霉菌作为生防菌应用于植物病害的研究多集中于木霉菌－植物－病原菌间的互作关系［10］，有关哈茨木霉在不同类型土壤中生存与定殖能力的研究报道很少，其主要原因是缺乏有效的菌株标记技术。
绿荧光蛋白基因具有稳定、直观、操作方便、不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测等优点，已经被转化到许多病原菌和生防菌中，如菌［11］、镰刀菌［12－13］、芽胞杆菌［14］，以及木霉菌属中的绿木霉Trichoderma virens［15］、长柄木霉T．longi-brachiatum［16］、哈茨木霉T．harzianum［17］、深绿木霉T．atroviride［18］等。本研究在尖孢镰刀菌绿荧光蛋白基因成
功转化的基础上［13］，采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系，将含有偃麦草核腔菌Pyrenophora triticirepentis的ToxA启动子和潮霉素B 磷酸转移酶基因（hygr）的质粒载体pCT74［19］转入哈茨木霉菌株FJAT-9040，并利用标记后的菌株跟踪观察菌株在不同类型土壤中的存活能力和作物对哈茨木霉菌株在土壤中定殖的影响。
1材料与方法
1．1材料
菌株：哈茨木霉菌株FJAT-9040和番茄枯萎病菌菌株FJAT-282均由福建省农业科学院农业生物资源所提供。菌株FJAT-9040抗潮霉素B的最低浓度为300μg/mL。
质粒：pCT74由美国Oregon大学Ciuffetti博士惠赠。
供试土壤：育苗土购自厦门市银龙种苗有限公司，菜园土采自福建同安郭山茄子种植地，沙质土采自福建农林大学沙滩，黄泥土采自福建同安郭山。
供试植物：15 20cm大小的茄子实生苗。
培养基：PDB培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、水1000mL；再生半固体培养基：马铃薯200g、蔗糖182g、琼脂9g、水1000mL。
交流网试剂：崩溃酶，Sigma公司；溶壁酶，广东微生物所；氨苄青霉素，Amresco公司；潮霉素B，Roche公司；Plasmid Mini Kit试剂盒，Qiagen公司；0．8mol/L NaCl；山梨醇溶液（STC，含1．2mol/L山梨醇、10 mmol/L pH7．5的Tris-HCl、50mmo1/L CaCl
2
）；PTC 溶液配制：取2g的PEG400溶解于山梨醇溶液中，并定容至5mL。上述除标注产地的试剂外，其余均为国产分析纯。
1．2方法
1．2．1原生质体制备
参照肖荣凤等［13］的方法，略作修改。接有菌株FJAT-9040孢子悬浮液的PDB培养液在28ħ、150 r/min摇床培养12 14h后用三层擦镜纸过滤收集菌丝，并用0．8mol/L NaCl充分洗涤后，取600mg菌丝体加入2mL含20mg/mL崩溃酶和溶壁酶的裂解液中，28ħ、70r/min消化4h左右。用三层擦镜纸收集滤液，室温3500r/min离心10min，弃上清液加20mL STC溶液5000r/min离心10min，弃上清，调整原生质体浓度约为107个/mL。
1．2．2菌株的转化及荧光稳定性检测
从LB平板中挑取活化培养24h的质粒pCT74的单菌落到含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，于37ħ、300r/min过夜培养。质粒DNA提取方法按Plasmid Mini Kit试剂盒的操作步骤进行。取5μg质粒DNA与200μL原生质体在离心管中混匀，室温静置20min，加入1 1．25mL PTC，轻轻混匀，室温放置20min。之后加入到100mL冷却至50ħ左右的含50μg/mL氨苄青霉素和300μg/mL潮霉素B的再生半固体培养基中，混匀后倒于底层已覆盖再生半固体培养基的平板上，28ħ倒置培养3 7天后获得转化子。第1代转化子经单孢分离后在普
705
6期肖荣凤等：生防菌哈茨木霉FJAT-9040的GFP标记及土壤定殖示踪
通PDA培养基上重复转接6代后，观察菌落形态，并挑取菌丝在荧光显微镜下观察菌丝及孢子的荧光强度，保存性状稳定的转化子。随机选取13个性状稳定转化子，以野生菌株为对照，采用CTAB/NaCl 法提取菌株的基因组DNA，利用gfp基因扩增引物P28/P29（5'-TAGTGGACTGATTGGAATGCATGGAG-GAGT-3'/5'-GATAGAACCCATGGCCTAT-ATTCAT-TCAAT-3'）扩增，目的片段大小约417bp。PCR扩增反应程序：94ħ预变性3min；94ħ变性45s，58ħ复性1min，72ħ延伸1min，35个循环；最后于72ħ延伸10min。PCR产物用1．5%琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶图像分析系统拍照。
1．2．3哈茨木霉菌株转化前后的生物学异质性生长速度差异：从1．2．2中挑选荧光性状稳定且菌落形态、泽与野生型菌株相近的转化子FJAT-9295，研究该转化菌株与野生型菌株FJAT-9040菌丝生长速率的差异。吸1mL孢子浓度为107CFU/mL的转化子FJAT-9295菌悬液至100mL PDB培养液中，28ħ、170r/min摇床培养1、3、5、7天时，过滤获得的菌丝烘干、称重。以野生型菌株FJAT-9040为对照，每处理3次重复。
产孢量差异：培养方法同上。分别取培养1、3、5、7天时的滤液，用血球计数板计数菌液孢子数。
酸碱环境的适应性差异：PDB培养液用80%乳
酸和过饱和Na
2CO
3
调节培养基pH值至4、6、8、10，
接种与培养方法同上。培养4天后过滤获得菌丝烘干、称重。以野生型菌株FJAT-9040为对照，每处理3次重复。
温度的适应性差异：吸1mL孢子浓度为107 CFU/mL的转化子FJAT-9295菌悬液至100mL PDB 培养液中，分别于20、25、30、35、40ħ下培养4天，过滤获得菌丝烘干、称重。以野生型菌株FJAT-9040为对照，每处理3次重复。
抑菌活性差异：采用平板对峙法，将直径均为6mm木霉转化子FJAT-9295与番茄枯萎病菌FJAT-282菌饼接种于PDA平板上，两菌饼间距6 cm，以野生型菌株FJAT-9040为对照，每处理3次重复。28ħ培养3天，观察结果，计算抑菌率。抑菌率（%）=［（对照菌落半径－处理菌落半径）/对照菌落半径］ˑ100。
1．2．4哈茨木霉在不同类型土壤中的定殖动态转化子FJAT-9295于PDB培养液中培养5天，过滤后调节孢子悬浮液浓度为107CFU/mL。取菜园土、育苗土、沙质土和黄泥土各500g于盆钵中，分别与50mL孢子悬浮液充分搅拌均匀，使土壤中的孢子数量为106CFU/g，60% 70%湿度下保湿培养，每处理重复3次。于第2、4、8、16、32和64天定期取样，取10g土样采用稀释涂板法分离计数，用含有终浓度为300μg/mL潮霉素B的PDA培养基培养2天后在体视荧光显微镜下检测发绿荧光的哈茨木霉菌落数，计算每克土中的菌落数。
1．2．5作物对哈茨木霉菌株定殖的影响
试验方法同1．2．4，生防菌与土壤充分混匀后设2个处理，处理组1为土壤中不种植物的对照组，处
理组2为土壤中种植15 20cm大小的茄子实生苗，比较作物对菌株FJAT-9295在土壤中定殖的影响。
1．3数据统计分析
试验数据利用DPS3．01软件进行统计分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。大胆猜想与小心求证
国有资产评估管理办法2结果与分析
2．1菌株的转化及荧光稳定性
新鲜菌丝酶解4h后过滤所得到的原生质体浓度可达108个/mL，且大小不一、圆球形，符合转化要求的原生质体可达90%以上。采用PEG-CaCl
2
介导的原生质体转化，每微克质粒可获得36个转化子，经过300μg/mL潮霉素筛选，随机挑选50个发光良好的转化子进行继代培养。不同转化子的菌落颜略有不同，大部分转化子的菌落颜与野生型菌株相似，少数转化子的菌落表面颜呈灰白至白。转化子的菌丝体、分生孢子梗及分生孢子在荧光显微镜下均能表达出强烈的绿荧光（图1）。绿荧光蛋白基因转导的验证，以P28/P29为引物，对随机挑选的13个转化子DNA进行PCR扩增，均扩增出1条417bp左右的片段，而阴性对照未扩增出相应条带（图2），说明该gfp基因已经转入到菌株中。
2．2哈茨木霉菌株转化前后的生物学异质性野生型菌株FJAT-9040及转化子FJAT-9295在菌丝生长速率、产孢量等方面无显著性差异（P＞0．05）；转化子FJAT-9295对酸碱度及温度的适应性与野生型菌株间也无显著性差异（P＞0．05）（图3）。摇床培养5天时野生型菌株FJAT-9040与转化子FJAT-9295对番茄枯萎病病原菌的抑菌活性分别为69．20%和66．50%。
805植物保护学报38卷
图1哈茨木霉菌株FJAT-9040转化子在荧光下的形态Fig．1The transformant morphology of Trichoderma harzianum strain FJAT-9040under UV-light
注：a ：菌丝体；b ：分生孢子梗；c ：分生孢子。Note ：a ：Mycelium ；b ：conidiogenous cells ；c ：
conidia．
图2转化子的gfp 基因PCR 扩增结果
Fig．2The PCR product amplified using primer specific for the gfp gene from the transformants
注：M ：DL3000marker ；1 13：转化子；14：质粒pCT74；15：阴性对照。Note ：M ：DL3000marker ；1－13：transformants ；14：plasmid pCT74；15：negative
control．
图3转化子FJAT-9295与野生型菌株FJAT-9040的生物学异质性Fig．3Comparison of biological characteristics between the transformant
FJAT-9295and the wild type strain FJAT-9040
注：相同取样时间、
pH 和温度的各处理相同小写字母表示经Duncan 氏新复极差法检验无显著差异（P ＞0．05）。Note ：The data with same lowercase letters mean no significant difference among treatments within the same culture time ，pH and temperature at P ＞0．05level by Duncan ’s multiple range test．
9
056期肖荣凤等：生防菌哈茨木霉FJAT-
9040的GFP 标记及土壤定殖示踪
2．3哈茨木霉菌株在不同类型土壤中的定殖动态
菌株FJAT-9295在各类型土壤中随着定殖时间的延长，菌落数逐渐下降。前8天处于一个波动状
鲎血
态，
育苗土中的存活菌落数最高，保持在7ˑ105
CFU /g 以上；其次为沙质土及菜园土，保持在4ˑ
105CFU /g 以上；而在黄泥土中的存活菌落数最少，
约为2ˑ105 4ˑ105
CFU /g 。处理16天后，各类型土壤中菌体的存活数量差异不显著，菌落数虽较初
始接菌量下降了约1个数量级，但仍能稳定在105
CFU /g （图4）
。
图4菌株FJAT-9295在4种土壤类型中的定殖动态Fig．4Colonization of strain FJAT-9295in four types of soils
注：相同取样时间各处理不同小写字母表示经Duncan 氏新复极差法检验差异显著（P ＜0．05）。Note ：The data with different lower-case letters mean significant difference among treatments withi
n the same culture time at P ＜0．05level by Duncan ’
s multiple range test．2．4作物对哈茨木霉菌株定殖的影响
生防菌与土壤混匀处理后的前8天，菌株
FJAT-9295的菌落数略有下降，但在各类型土壤中
种植茄子植株的处理组2的菌落数均明显高于未种
植物的处理组1；16 64天期间，
各类型土壤中处理组2与处理组1的菌落数差异不显著（图5）
。
美国俄亥俄州图5作物对哈茨木霉菌株定殖的影响
Fig．5Effects of plant on colonization of strain FJAT-9295in the soils
注：A ：育苗土；B ：菜园土；C ：沙质土；D ：黄泥土。相同取样时间各处理不同小写字母表示经Duncan 氏新复极差法检验差异显著（P ＜0．05）。Note ：A ：Nursery soil ；B ：garden soil ；C ：sandy soil ；D ：loess soil．The data with different lowercase letters mean significant difference among treatments within the same culture time at P ＜0．05level by Duncan ’s multiple range test．
15植物保护学报38卷
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