现代分子生物学论文
学 院 食品科学与工程学院
专 业 生物工程
年 级 2011级
姓 名 好学生
学 号 2011111111
完成日期 2013年7月9日
克隆技术的研究
基因是遗传信息的载体，生物的性状以及许多疾病都是由基因决定的。19世纪限制性内切酶的发现以及质粒作为载体的应用，共同推动了体外重组技术的发展，使基因的分子克隆成为 可能。
一、综述
克隆基因的途径有两种，正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的；后者则着眼于基因本身，通过特定的序列或在基因组中的位置进行。近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆，到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术：差异表达,基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等。基因克隆技术中代表性的方法主要有：根据现有基因序列的同源克隆(homology cloning) 太极图解
、根据基因表达产物的功能克隆(functional cloning)(Bogan 等 2003)、根据连锁图谱的定位克隆(positional cloning)或图位克隆(map-based cloning)(Arondel 等1992)以及根据表型差异的表型克隆(phenotype cloning) (Jonsson和Weissman 1992)。 二、初步发展
过去20年，人们已经分离到了相当数量的与发育相关的基因.这主要借助于蛋白质产物的
分离纯化，然后根据其氨基酸结构推算其相应的核苷酸序列，并据此合成寡核苷酸探针，最终从cDNA文库或基因组文库中筛选出目的基因。而未知其编码产物的发育基因的分离克隆则是非常困难的工作，以前广泛应用的主要方法有 DNA标签法( DNAtagging)，作图克隆法(map-based cloning)，差别筛选法(differential screening)和扣除杂交法(subtractive hybridization)。这些方法虽然都取得了一定的成功，但由于各自的缺陷性，而限制了它们更加广泛的应用。近年来在PCR技术的基础上，人们已经建立了若干种分离克隆植物发育基因的新方法。1992年，Liang P和Pardee A首次提出并运用了mRNA差别显示技术(mRNA differential display reverse transcription- PCR， DDRT-PCR) 来进行基因的分离。实践表明， mRNA 差别显示技术在分离、鉴定差别表达的新基因方面与以前的各种技术相比有其独特的优越性，但同时它也存在着重复性较差等缺点。因此，最近研究工作者又在其基础上，发展了诸如代表性差式分析( representational difference analysis， RDA)和抑制性扣除( 或减去) 杂交( suppression subtractive hybridization，SSH)等一些更新的方法。
三、克隆差别表达基因方法的进展
由于mRNA差别显示技术存在上述诸多缺点，人们将目光投向新发展的克隆差别表达基因的技术上，其中较引人注意的有代表性差示分析(RDA)和抑制性扣除杂交(SSH) 两种方法。与差别显示技术相比，它们都具有假阳性少，重复性高等特点。代表性差式分析技术最早由管理层收购Lisitsyn N等应用于基因组的差异比较研究上，1994年Hubank M 和Schatz D G将其应用于克隆差别表达基因上，获得了成功。代表性差示分析技术充分发挥了 PCR 以指数形式扩增双链模板，而仅以线性形式扩增单链模板这一特性，通过降低cDNA 体复杂度和多次更换cDNA 两端接头等方法。
四、五种基因克隆技术
经华中农业大学周国岭先生对国内外64篇有关基因克隆技术的论文概括和分析，当前基因克隆技术主要有5个类别,即体位克隆或状态克隆、转位或转 DNA 标记法、同系位候选基因法、快捷顺序标记法、差接式快捷基因克隆法等。
1.体位克隆或状态克隆
首先将目的基因精确定位于分子标记连锁图上，用连锁标记筛选大片段 YAC，BAC，TA
C，PAC或 Cos2mid等文库，构建含目的基因区的精细物理图谱，采用染体操作法逐步接近目的基因，如拟南芥的 WIG2GUM 基因克隆人的NPC1基因克隆。
东芝m302.转位或转 DNA 标记法
此法有五大基本程序，即首先进行突变体的诱变和鉴定；第二用转位或转 DNA作标记DNA制成探针或引物筛选突变体基因组文库；第三用反义PCR技术分离出标记DNA两侧的目的基因部分序列；第四依据序列设计探针或引物筛选野生型基因组文库，并分离出完整的基因；第五用基因互补测验手段检测此法的功能。
3.同系位候选基因法
为同源序列候选基因法，根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计引物，以此对含有目的基因DNA文库用PCR扩增,再扩增、克隆和功能鉴定。
4.快捷顺序标记法(EST)
在人类基因组和其他生物组计划及计算机的运用过程中，EST 是完整基因上能特异性标记基因的一部分序列，它包含了基因结构信息区，可与其他基因相区别。
5.差接式快捷基因克隆法
亦为差异表达基因分离法，其表达基因的3种方法为差式筛选、扣除杂交、差异展示反转录PCR(DDRTPCR)。
五、克隆差异表达基因的新策略
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基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置，分离并克隆差异表达基因不仅有助于揭示生命的奥秘，而且还能为基因诊断与提供重要的理论依据. 基因表达的变化有两种,即新出现的基因表达与表达量差异的基因表达，以前过多强调克隆新出现的表达基因，忽略表达量差异的基因.目前研究认为表达量差异的基因表达对信号转导调控的意义更大，分离并克隆表达量差异的基因对揭示生命的奥秘更具有意义。消减杂交、代表性差示分析、抑制性扣除杂交、Order 差示分析等在分离克隆新出现的表达基因方面具有明显优势，而且所获基因在 RNA 上海市轨道交通近期建设计划(2017-2025)印迹上重现性好，假阳性少，缺点是所需起始材料较多。这些技术比较成熟，近几年无明显改进；表达量差异的基因克隆技术主要有mRNA 差异展示，此技术是目前筛选差异表达基因最有效的方法之一，但存在不足，针对这些缺点， 近几年出现了较大改进，并提出了新的策略及方法。
六、基因克隆技术的一些进展
近几年来研究的中心是真核基因表达的调控机理，很多实验室围绕这个中心开展了以下课题的研究细胞增殖和分化的调控，癌变机理，尤其是癌基因及其表达产物的结构和功能,组织专一性和发育阶段专一性的基因调控，鉴定和分离作用的调控序列的调控蛋白，免疫系统重要分子的基因工程。在人类基因组计划的推 动下，数种有效的基因克隆技术相继间世。这些方法不依赖于 已知基因的位置和功能，直接在基因组中从DNA和RNA水平获得有意义的目的基因片段。
1.基因组错配筛选
GMS，GMS是一种直接绘制与疾病相关的配对人中血缘同一 区域的基因图谱,从而克隆与疾病相关基因的连锁分析方法。
2.代表性差异显示
DNA代表性差异显示是通过突变型,与野生型基因组之间的差异比较来分离和鉴定突变基因的方法。
3. 外显子扩增技术
(ex on一PCR)外显子扩增技术是利用m R NA转录后发生剪切的事实，使外源D N A片段中的外显子与克隆位点两侧已知序列的外显子在受体细胞内剪接，经RT一P CR扩增得到外源D N A片段中的外显子，主要应用于任何区域内基因的分离和鉴定。我国的生物技术有了较快的发展，克隆抗虫、抗病、抗杂草以及提高植物品质的基因已达22种，而且很多转基因作物已进入田间试验阶段 ， 我国的番茄和辣椒现已有5种转基因品种投入商品化生产，由于多种植物高密度分子标记、连锁图谱的构建、大片段 DNA 克隆系统的建立、序列测定技术和基因遗传转化技术的发展，许多未知基因的克隆都将成为可能。
七、植物克隆基因的研究方法
1.PCR扩增克隆 是一种已知植物基因序列的基础上进行基因序列克隆的一种方法，根据已知的基因序列合成一对引物，从植物中提取 DNA进行PCR扩增，然后对扩增的片段进行纯化并连接到合适的载体上，用酶切分析和序列分析检测重组子，并与已知的基因序列进行比较鉴定 。2.表型基因克隆法 有很多植物既不了解它的基因产物，也没有对它们进行基因定位，但已知植物在表现型上存在着差异，利用表现型差异或组织器官特异表达产生的
差异来克隆植物基因就是表型克隆。3.转座子标签技术 转座子标签技术是将转座子或T-DNA插入到欲分离基因的内部或附近，基因发生突变而被标识，然后利用插入DNA片段作探针，克隆到该基因上。4.mRNA差异显示法 高等植物所有的发育和生理变化技术过程，不论是单基因还是多基因控制，都是通过基因表达的质或量的差异而体现出来。5.功能克隆 功能克隆是根据性状的基本生化特性这一功能信息，在鉴定已知基因功能的基础上克隆6.同源序列克隆基因 生物的种、属之间编码基因的同源性高于非编码基因区的序列，此方法的基本操作是在其他属种中的同源序列被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后以已知的基因组序列为探针来筛选目的克隆。7.DNA芯片技术 DNA芯片技术是由核酸片段如一系列用特定荧光标记的寡核苷酸探针，以预先设计排列的方式固定在载玻片或尼龙膜上组成生物集成膜片，与不同标记的游离靶分子杂交，或生物集成膜片的不同靶分子与游离的探针杂交，然后应用荧光信号检测器及处理器根据杂交分子和未杂交分子发出不同波长的光检测杂交信号。8.定位克隆技术 根据目标基因在染体上的位置进行基因克隆的一种方法。
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