#l(42!"a
—88一
D01：10.12161/j.issn.l005-6521.2021.01.015
乳化性质的影响
胡海壬月1，闫可心打赵娅柔打何琳琳2，汪建明11
(1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津300457:2.天津市利民调料有限公司，天津300000)
摘要：为探究冷冻对大豆分离蛋白结构和乳化性质的影响，选取0.04g/mL大豆分离蛋白溶液进行研究，以-5! 和-20!作为冷冻温度，冷冻3d。通过傅立叶红外光谱、内源荧光光谱、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、静态多散射稳定性分析仪以及倒置荧光显微镜等方法，研究冷冻处理对大豆分离蛋白微观结构以及乳化性质的变化影响。结果
表明，经冷冻处理和未经冷冻处理的大豆分离蛋白亚基组成基本相同，冷冻使蛋白产生可逆变性；冷冻处理后的样品最大吸收峰在340Dm，证明冷冻后的大豆分离蛋白三级构象发生变化；冷冻后蛋白的B-类型结构均少于80%，p-折叠和无规卷曲结构增多、B-转角减少，表明冷冻使大豆分离蛋白结构趋于无序化。通过研究浓度为0.002g/mL大豆分离蛋白乳状液的粒径分布、稳定性和微观结构，发现未经冷冻处理的大豆分离蛋白乳状液粒径多数在20"m以下，冷冻后，乳状液粒径峰型变宽，多数粒径分布在10"m〜50"m之间，表明产生了聚集体；通过对乳状液微观结构的观察和对稳定性的测定，发现冷冻大豆分离蛋白乳状液中存在蛋白聚集体，且稳定性与未经冷冻处理蛋白乳状液相比明显较差，表明冷冻处理对于大豆分离蛋白的结构及乳化性质带来不利影响。 关键词：大豆分离蛋白；冷冻处理；乳状液；三级结构；稳定性
Effects of Freezing on the Structure and Emulsifying Properties of Soybean Protein Isolate
HU Hai-yue1,YAN Ke-xin1,ZHAO Ya-rou1,HE Lin-lin2,WANGJian-ming1S
(1.College of Food Science and Engineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457,
China;2.Tianjin Limin Condiment Co.,Ltd.,Tianjin300000,China)
Abstract:In order to explore the effect of freezing on soybean protein isolate(SPI),this research chose
0.04g/mL soy protein isolate solution for research,used-5!and-20!as freezing temperature for3days,
and used Fourier infrared spectroscopy,endogenous fluorescence spectroscopy,sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE),inverted fluorescence microscope and other methods to investigate the changes in microstructure and emulsifying properties of SPI.The electrophoresis results showed that the composition of the frozen SPI subunits was basically the same as that of the non-freezing SPI,indicated that freezing made the protein reversible;through endogenous fluorescence spectroscopy,it was found that the maximum absorption peak of the frozen samples were at340nm,tertiary conformation of the frozen SPI changed;application Fourier infrared spectroscopy and Gaussian smoothing and deconvolution analysis of the spectrum showed that the that the!-type structure of the protein after freezing was less than E0%,!-sheet and random coil structure of the protein increased after freezing,and the!-turn decreased,indicated that the freezing made the structure of the SPI tended to be ordering.Through studied the particle size distribution, stability and microstructure of the0.002g/mL SPI emulsion,it was found that the particle size of the SPI emulsion without freezing treatment was mostly below20"m.After freezing,the particle
size peak shape of the
基金项目：天津市一二三产业融合发展科技示范工程(1EZXYENC00090)；天津市自然科学基金项目(18JCYBJC43700)；天津市合成生物技术创新能力提升行动重大科技攻关任务(TSBICIP-KJGG-004-09)
作者简介：胡海f(1997—)，女(汉)，硕士研究生，研究方向：食品科学与营养。
s通信作者：汪建明(1972—)，女(汉)，教授，博士，研究方向：食品科学与营养、农产品加工。
应用技术
—----------------------------------------------------------------------------------89_■emulsion had widened,and most of the particle size distribution were between10|xm-50|xm,indicating that aggregates were produced;Through the observation of the microstructure of the emulsion and the determination of the stability,it was found that there were protein aggregates in the frozen SPI emulsion and the stability was significantly worse than that of the protein emulsion without freezing,it showed that freezing treatment had an adverse effect on the structure and emulsifying properties of SPI.
Key words:soybean protein isolate;freezing induction;emulsion;tertiary structure;stability
引文格式：
胡海(，闫可心，赵娅柔，等•冷冻处理对大豆分离蛋白结构和乳化性质的影响[几食品研究与开发,2021,42(1):88-93.
HU Haiyue,YAN Kexin,ZHAO Yarou,et al.Effects of Freezing on the Structure and Emulsifying Properties of Soybean Protein Isolate[J].Food Research and Development,2021,42(1):88-93.
大"分离蛋白（soybean protein isolate,SPI）是一种全价粉状食品原料和食品添加剂，是将低温脱溶豆粕作为原材料［1］，经过一系列加工生产出来的。其蛋白质含量超过90%［2］，并包含人体必需的20种氨基酸［3］，具有较高的营养价值。大豆分离蛋白因其原料成本低、来源较为广泛叫在食品工业生产中应用较多［"。大豆分离蛋白是一种表面活性剂，可以降低水和油的表面张力，形成稳定的乳状液，所以作为乳化剂应用在冷食品中。是食品工业生产和生活中食
的叫在实际生活和工业生产过程中，大豆分离蛋白在处理后会生一定的变性［8］，含有添加大豆分离蛋白食物的和质量。茏
因工业食品的开发和销售。
蛋白质在力作用较［9］。
生变（处理，离变）［102，蛋白质的活性基可会出来，价和
价。然而，目前对大豆分离蛋白的多中在糖基化、热处理、超和高面011-19m Ahmed Taha等阴超乳含中 油三酸酯（medium chain triglycerides，MCT）的大豆分离蛋白乳液的理性质的，高超（high intensity ultrasound，HIU）可以辅助生产出稳定的大豆分离蛋白乳液。［12］大豆分离蛋白性和的，基性大豆分离蛋白质后，其和生了变化，并生应。本文从大豆分离蛋白的的变，应用基酸-
胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、内源荧光光谱以及傅立叶红光谱法，探大豆分离蛋白和乳状液的粒径分布、微观结构和稳定性的影响，并对照样品进行比较，以期为工业上优植蛋白
法提供理论支持。
1材料与方法
1.1材料与仪器
大豆分离蛋白（蛋白含量90%以上）：河北塞亿生物科技有限公司；罗丹明B（分析纯）、考马斯亮蓝（R250，指示剂）：北京Solarbio科技有限公司；磷酸氢、磷酸二氢分析纯）：北京鼎国生技术有限公司；过硫酸铅（分析纯）：上海研域生物科技有限公司；基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，S
DS）（分析纯）：生工生工程有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2仪器与设备
海尔冰箱（BCD-175F）：青岛海尔股份有限公司；荧光分光光计（RF-5301pc）：本津岛公司；紫外-可见分光光计（SP-752）、泳仪（DYY-⑵：
海舜宇恒平科技仪器有限公司；紫可见分光光计（Evolution300）:Thermo Fisher Scientific公司；傅里叶红外光谱仪（NICOLET IS50）：德国Thermo Scientific公司;Tuibiscan ASG多稳定性分析仪：北京科技有限公司；荧光CKX41）：日本日立公司。
1.3方法
1.3.1大豆分离蛋白的备
将大豆分离蛋白与水比合，使其蛋白浓度为0.04g/mL，在室温（25!）下利用磁力搅使其充分合均，20min。器X为40cm x 20cm）中，在-5!和-20!。将后的大豆分离蛋白在室温（25!）下使用的水。将
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食品#究％开发
90
解冻后的大豆分离蛋白放入鼓风干燥箱中在40 !下 烘干#h ，烘干后的样品进行粉碎，过筛(80目)，放入 干燥器中储存备用。
1.3.2大豆分离蛋白分子量的测定
利用SDS-PAGE 电泳对大豆分离蛋白的分子量 进行测定［16］，得到冷冻处理后的大豆分离蛋白SDS- PAGE 电泳图。
1.3.3大豆分离蛋白三级结构测定使用荧光分光光度计测定大豆分离蛋白的三级
结构。将待测样品溶于0.01 mol/L g pH 值为7.0的磷酸
盐缓冲液中，配制成1 m;/mL 的溶液。在激发波长为
290 nm 、灵敏度为2 nm 、狭缝为5 nm 的条件下，以蛋白
质内荧
为荧 ，白 为磷酸盐缓冲液，测定 波长在300nm?400nm 的荧光光，
得到冷 豆分离蛋白聚集体的荧光光 图。1.3.4
豆分离蛋白二级结构的测定
准确 量1 m；大豆分离蛋白样品和充分干燥的 150m;(105 °C ,8h )，分 后 粉，桂枝二陈汤
制成
，使用 光 进行波 I
描(4 000 cm -1〜400 cm -1)，以空气为背景，设定4 cm -1 分 , 16 , 过 得到样品光谱图。
1.3.5
豆分离蛋白 液的制备
将豆分离蛋白样品溶于离子水中，配制 0.002 g/mL 豆分离蛋白去离子水溶液， 2 h
(25 C )后以 1 :3(体 缓 入大豆 :
得到 液，加入0.25%(于 液体 的
0.02%
,
后放入 质
中，在12 000 r/min 条件下处理3 min ，制得均匀的大
豆分离蛋白乳状液切。1.3.6 豆分离蛋白
液液 分 测定
Feng 的
0182，测定 豆分离蛋白乳状液
粒径。
1.3.7
豆分离蛋白 液用 荧光
豆分离蛋白乳状液
的
叫将制备的样品 液0.5 mL 在
，用 B ,
，放
入 荧光 下，对 液 进行观察和
1.3.8
豆分离蛋白 液 定 测定(turbiscan stability index ,TSI )
量取大豆分离蛋白乳状液25 mL ，放入Turbiscan
测 瓶中。冷 豆分离蛋白分散液的 定 力学 指数应用静多散 定分析进行测定［19］o 取 0.1 g 样品放入30 mL 0.01mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲
液中，磁力搅拌2 h (25 C )后放入Turbiscan 测试瓶中。 在温度26 C ,30 min 扫描1次，测定6 h o 以未冷冻处
理的豆分离蛋白作为对照组。1.3.9统计分析
所有 验 重复测定3 , 验数据通过Excel 2007和Orign 8.0进行统计分析。使用Adobe Photo
shop CS6对图片进行处理。2结果与分析
2.1冷处理对大豆分离蛋白分子量的影响
为 究经过冷 处理后的 豆分离蛋白分子量
的变化，对冷冻处理后的大豆分离蛋白作SDS-PAGE 凝胶电泳分析结果见图1。
通道1代表未冷冻的大豆分离蛋白；通道2和通道3分别代表-5 C
和-20 C 冷冻温度下冷冻3 d 后的大豆分离蛋白；通道4?6分别代
表在-20 C 冷冻温度下，冷冻10、5d 和Id 的大豆分离蛋白；A 酶
性亚基;B 碱性亚基。
图"0.04 g/mL 大豆分离蛋白冷冻处理后的SDS-PAGE 电泳图 Fig ・1 SDS-PAGE electrophoresis pattern of 0.04 g/mL SPI after
freezing treatment
7S 和11S 是大豆分离蛋白的两种重要组成成分。
11S 是通过二硫键将一个酸性(A 亚基)和一个碱 B
亚多肽链连接而成。7S 主要是过疏相互作
用，将！'、！、和"亚 相互连接而成。如图1所示，将 道2、3、5、6与通道1进行对，发现其样品中的亚日落黄
基组成与对照组相似，主要亚
为7S 和11S ，化
并不 著。这说 豆分离蛋白经-5 C 和-20 C 冷冻
处理后，产生的
huvec细胞
多 为可逆 国，但通道4的条
带较为分散，说长时间的冷处理会使豆分离蛋
白产生不可逆。且所有冷后的样品与未经冷冻 相，条带都有所变浅，证 冷 使 豆分离蛋白都
产生了聚集行为，成了不溶 的聚集体，从而 致
分子量的
。
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2.2冷冻处理对大豆分离蛋白三级结构的影响
内源荧光性质可以显示因蛋白质聚集导致的蛋 白分子内部各基团距离减少的变化，而引起蛋白质内
源荧光发射光谱的主要氨基酸残基为氨酸。因此, 通过内源荧光发射光谱能够反映氨酸微环境的极
性变化过程，且通过内源荧光光谱中最大峰的荧光强
度和位置的变化，可以较为准确地判断蛋白质在三级
结构水平上的构象变化情况#叫图2显示冷冻处理 对大豆分离蛋白聚集 荧光强度的影响。91 -—
氨酸残基 在的微环境
最大的
, 大 分的氨酸残基 蛋白分子内 的 极
性环境 ， 最大 波小于330 nm ；
氨酸残基处于蛋白分子外部的极性环境中，表明氨酸残
基再蛋白分子的极性环境 强度变
, 最大 大于330nm #22%。图2
可以 ， 的最大
大于330 nm 。
而在-5!下处理的
最大 峰的峰 于-20 !
的峰，最大
峰
程度 大，且最大
——
对 •一一 -5 !— -20 !
0 ------------------------------------------------——300 320 340 360 380
波长/nm
图2冷冻处理大豆分离蛋白聚集体的荧光光谱图
Fig.2 Fluorescence spectrum of aggregates of frozen induced SPI
峰的峰强
，
这种现象表明氨酸残基的微环境极
性 ，荧光基团 地 在 中，蛋白质
聚集 导致蛋白分子内部的基团
的距离 , 而
引起内源荧光强度的变化。以上结
明，冷冻导致
蛋白质聚集，从而 变了大豆分离蛋白的三级构象。
2.3冷冻处理对大豆分离蛋白二级结构的影响
蛋白质的二级结构 的 构。这
些氢键在主肽链中组成具有规则性的周期空间构象,
构 级结构的基 。
外光谱中的酰
I 可以
蛋白质的二级结构。冷冻 导大豆分离蛋白的
夕卜 光谱图图3。
1.61.41.21.00.80.60.4
对照组
Z 9.80
寸
E .
0.700.600.500.400.300.20
-5 !I O O Z
寸
E
0.60—20 !
°.50
4 000 3 500 3 000 2 500 2 000 1 500 1 000 500
波数/cm -1
图3冷冻诱导大豆分离蛋白的傅立叶红外吸收光谱图Fig.3 FT-IR spectroscopy of SPI induced by frozen
小周立波张冯喜0.400.300.20
岭寸S 寸
E
酰胺［带
从图3不同样品的吸收峰的峰形和吸光度变化可
以判断，冷冻处理引起了大豆分离蛋白二级结构的 变化。为
蛋白质二级结构 的变化程度，对酰
I 谱 的 峰(1 600 cm -1
1 700 cm -1 基
。对
光谱进行分析，结
1示。
1 可 , 蛋白质的 级结构主要 主 上的
拨基和 基 的
，主要 ！-
"
-"
-
和 。蛋白质在环境
变化，蛋白质分子
构象重排以达到稳 状态。
表1冷冻对大豆分离蛋白二级结构单元含量计算结果的影响
Table 1 Effect of freezing on secondary structure element content
of SPI
冷冻体系-
级结构 含量/%!
-
"
-
"
-
无规卷曲
对9.90±0.01a 32.71 ±0.04a 50.21±0.03a
7.18±0.01a -5 !12.05±0.01:44.08±0.02:35.16±0.01:8.71±0.03:
-20 !
11.32±0.014
547.33±0.03c
31.69±0.12c
9.16±0.11c
注：样品为3次测定的平均值；不同小写字母表示参数间存在显
著性差异(p<0.05)
o
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第42卷第1期食品硏究与&'应用技术—92
未经处理的大豆分离蛋白的!-类型结构82.92%，其
中！-折叠和！-转角的含量分别为32.71%和50.21%,
而"-螺旋和无规卷曲相对较少，分别为9.90%和
四猜想7.18%。经冷冻处理后，样品的！-类型结构均少于
80%,!-折叠的含量增加,!-转角的含量降低，表明冷
冻可能会导致蛋白质聚集。而"-螺旋和无规卷曲含量
的增加表明蛋白质聚集为无序结构。结果表明，冷冻
处理后蛋白质变性，导致不同程度的蛋白质聚集，从
而对二级结构产生影响。
2.4冷冻处理对大豆分离蛋白乳状液的液滴分布的
影响
经冷冻处理后的大豆分离蛋白容易产生聚集，从而影响大豆分离蛋白的乳化特性。利用粒径分布可以判断冷冻对大豆分离蛋白乳状液的影响。乳状液的粒径分布如图4所示。引用男性
Fig.4Effect of freezing on particle size distribution of SPI
emulsion
从图4中可以看到，经冷冻处理后的大豆分离蛋白所的乳状液的液滴粒径分布变化较大。未经处理大豆分离蛋白乳状液中粒径分布集中且粒径最小，大20#m以下。冷冻处理后的大豆分离蛋白的乳状液粒径分布与对相比较为，峰型变宽，多数粒径分布在10#m〜50#m之间，经-5!冷冻后的大豆分离蛋白所的乳状液粒径峰值接近19#m，而-20!的粒径峰值为30#m。表明经冷冻处理，乳状液粒径变大，分布变较为分散。明乳状液中冷冻导的蛋白聚集[23]，且聚集
未为均质而被破坏。
2.5冷冻处理对大豆分离蛋白乳状液的微观形态影响
对蛋白乳状液的界面性质进行研究，可以了解蛋白的乳化性质和乳化能力。冷冻大豆分离蛋白乳状液的微观形态图片经过Adobe Photoshop CS6软件的白处理，如图5所示。
图5可以，大豆分离蛋白的乳状液中，形
A代表未冷冻大豆分离蛋白乳状液;B-C分别代表经过-5、
-20°C处理的大豆分离蛋白形成的乳状液。
图5大豆分离蛋白乳状液的微观形态图
Fig.5Microscopic morphology of frozen SPI emulsion
成的是水包油型的乳状液。在未经冷冻处理的大豆分离蛋白的乳状液中，滴分布而均匀，表明乳化果。未经冷冻处理的大豆分离蛋白的乳状液经冷冻的相的乳化能力。经-5C 和-20C处理的大豆分离蛋白乳状液的分布因为乳状液中蛋白聚集的而不均，
和粒径分布结果一致。
2.6冷冻处理对大豆分离蛋白乳状液稳定性的影响
对冷冻大豆分离蛋白乳状液的微观分，对冷冻大豆分离蛋白乳化，不能其的聚集结构，对大豆分离蛋白乳状液性图6。
图6冷冻温度对大豆分离蛋白乳状液稳定性动力学指数的影响Fig.6Effect of freezing temperature on the stability kinetics index
of SPI emulsion
性值，说明乳状液。由图6可以，未经冷冻的大豆分离蛋白的乳状液最为，经冷冻处理后的蛋白的乳状液的性生了不同程度的降低。[24-25]后，可能是蛋白质低粒径的可性聚集，从而乳状液的降，未经处理的大豆分离蛋白乳状液较，冷冻处理后的大豆分离蛋白乳状液的性较差
。
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