18 核酸类药物18.1 核酸类药物概述18.2 核酸类药物的理化性质18.3 核酸类药物 的功用18.4 核酸类药物通用生产方法与技术18.5 典型核酸类药物制造技术及工艺18.1 核酸类药物概述核酸类药物可分为两大类。一类为具有天然结构的核酸类物质，缺乏这类物质会使机体代谢失调，发生病态，提供这类物质，有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，临床上已广泛应用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等，属?谡庖焕嗟暮怂嵋┪镉?ATP、辅酶A、脱氧核苷酸、CTP、UTP、混合核苷酸、辅酶Ⅰ等。第二类为天然碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物，这一类核酸类药物是当今人类病毒、肿瘤、艾滋病等的重要手段。已经在临床上应用的抗病毒核苷酸类药物有以下一些品种：此外还有氮杂鸟嘌呤、巯嘌呤、6-氯嘌呤、氟胞嘧啶、氟尿嘧啶、呋喃氟尿嘧啶、氟苷、阿糖胞苷，环胞苷、肌苷二醛、异丙基苷、脱氧巯鸟苷、环腺苷酸、聚肌胞等。随着分子生物学和遗传工程的发展，基因应运而生，得到广泛的肯定。其中包括反义核酸技术，简称反义技术。利用这一技术研制的药物称为反义药物，根据核酸杂交原理，反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰疾病蛋白的生产过程，及干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。蛋白质在人体代谢中扮演着非常重要的角，几乎所有的人类疾病都是由蛋白质的异常引起的，无论宿主疾病病毒等还是感染疾病肝炎等。传统药物主要是直接作用于致病蛋白本身，而反义药物则作用于产生蛋白的基因，因此可广泛应用于多种疾病的防治。反义药物作为药物与常规药物相比有两个显着特点：①有关疾病的靶基因序列是已知的，因此，设计合理特异性的反义核酸比较容易；②反义寡核苷酸与靶基因能通 巨磁阻传感器
过碱基配对原理发生特异和有效的结合从而调节基因的表达。它的缺点是天然的寡核苷酸难以进入细胞内，而一旦进入又易被胞内核酸酶水解，很难直接用于。Fomivirsen 是全球批准上市的第一个反义药物，1998 年已被美国FDA 批准上市，用于二线AIDS 所致的巨细胞病毒CMV视网膜炎。核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的基因DNA 或RNA直接导入人或动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗原蛋白质的免疫应答以达到预防疾病的目的。核酸疫苗又称基因疫苗或者基因免疫。DNA 疫苗为目前尚无满意疗法的某些疾病如慢性病毒性肝炎、疟疾、艾滋病提供一种新的途径。HBV DNA 疫苗可选用编码HBSAg 或HBeAg 的基因序列构建重组质粒。动物模型中，乙肝DNA 疫苗引起的体液免疫和细胞免疫优于传统疫苗，预示着其可作为抵抗乙肝的预防性疫苗；而且DNA 疫苗能克服HBV乙肝病毒转基因小鼠的免疫耐受表达HBV 蛋白，为了治愈慢性乙肝患者提供了可能。肿瘤细胞由于缺乏免疫原表位而在体内不易诱发抗体，这促使多表位DNA 疫苗的出现。Velde r等构建了4 种多表位螺旋DNA 疫苗，分别含有乳头瘤病毒16 型的CTL、Th 细胞、B 细胞表位等。试验证明携带一种表位的DNA 疫苗即能100保护接种过的小鼠抵抗致死肿瘤的攻击。18.2 核酸类药物的理化性质核酸类药物的理化性质与大家在生化教科书上所学的核酸类物质一样，在此不再多述。18.3 核酸类药物的功用核酸类药物具有广泛的药理作用和功能。不同的核酸类药物具有不同的药理作用和功能，同一类/种核酸药物又具有多种的药理作用和功能。例如，具有天然结构的核酸类物质像ATP、辅酶A、脱氧核苷酸有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，天然碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物具有抗病毒、肿瘤、艾滋病等功能。如阿糖腺苷是近年来 引人注目的广谱DNA 病毒抑制剂，对单纯疱疹Ⅰ、Ⅱ型，带状疱疹，巨细，牛痘等DNA 病毒，在体内外都有明显抑制作用。三氮唑核苷商品名病毒唑，对DNA 病毒、RNA 病毒都有广泛作用。三氮唑核苷除了主要用于小儿呼吸系统的疾病外，已试用于猩红热、流感以及艾滋病的，特别在临床上艾滋病患者试用，能明显的改善患者症状，而且毒副作用比AZT 小，药物价格与AZT 差50 倍，因此，在抗病毒药物中已成为一个物美廉价的品种。聚肌胞具有抗病毒、抗肿瘤、增强淋巴细胞免疫功能和抑制核酸代谢等作用。18.4 核酸类药物通用生产方法与技术由上述可知，不同的核酸类药物应该有不同的生产方法与技术，但综合起来，主要有下列几种：18.4.1 RNA 与DNA 的提取与发酵法制备1.RNA 的提取与发酵①RNA 及其工业来源。从微生物中提取RNA 是工业上最实际和有效的方法。人们已经发现一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源，如啤酒酵母、纸浆酵母、石油酵母、面包酵母、白地霉、多种抗生素的菌丝体----青霉素、制霉菌素等菌体。通常RNA 在细菌中占5-25，在酵母中占2.7-15，在霉菌中占0.7-28，面包酵母含RNA4.1-7.2。RNA 含量的变化受培养基组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA，在工业上主要有RNA 生产5-核苷酸。Agata 报道，他们测定了500 株酵母菌在最佳培养条件下RNA 的含量，发酵培养18h RNA 含量3.5-9.2，培养42h RNA 含量 2.3-5.8，很显然在许多酵母中，早期细胞的RNA 含量高，其确切数值取决于碳、氮比例和培养基的组成等。当用醋酸培养假丝酵母时，在培养基中加入10-50的葡萄糖，可较显着地提高菌体RNA 含量。用5三，100℃水解适量菌体15min，然后用光谱法测定其中嘌呤、嘧啶碱基总值，并以此可计算出RNA 含量。②高RNA 含量酵母菌株的筛选。可以从自然界筛选
到RNA 含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA 含量。铃木庸介筛选到一株野生型酵母，他以糖蜜为碳源，最适温度30℃，最适pH4.5，菌体RNA 含量达16，菌体的粗蛋白质达65。秋山峻一将一株解脂假丝酵母经亚硝基胍NTG处理得到一株对氯化钾敏感的变异株，用醋酸为碳源，菌体RNA 含量高达17.8。在高含量RNA 的菌株中，经较系统地筛选发现解脂假丝酵母和清酒酵母属RNA 含量普遍较高。如上海市工业微生物研究所用诱变育种的方法选育到一株假丝酵母RNA 含量为10-15RNA/干菌体，干菌体收率1-1.5W/V。中科院有机化学研究所用亚硝基胍诱变热带假丝酵母，得到一株诱变菌RNA 含量达14。生产高RNA 含量酵母及RNA 工艺流程见图18-1。③用工业废水培养高RNA 酵母。使用工业废水培养高含量RNA 酵母不仅可以减少公害，而且节约培养酵母所需粮食。一般味精生产废水中含有还原糖高达0.7、总糖 1.2、总氮0.2、总磷0.5、无机盐0.1-0.2，这些成分基本上可供酵母生长，如使用高含量RNA酵母在味精废液中驯化培养，发酵菌体收率1-1.5W/V，RNA 含量可达8-10。④RNA 的提取实例。啤酒酵母是提取RNA 的很好资源。取100 g 压榨啤酒酵母含水分70，加入230 ml 水含3 g 氢氧化钠，20 ℃以下缓慢搅拌30min。用6mol/L 盐酸调节至pH2.5，搅拌15min，离心得清液255ml。冷却至10℃以下，用6mol/L 盐酸调节至pH2.5，置冷过夜，离心得RNA1.8g纯度80。图18-1 ↑↑↑↑ 图序号应该改正2.DNA 的提取制备（1）工业用DNA 的提取取新鲜冷冻鱼精20Kg，用绞肉机粉碎两次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100℃，保温15 min，迅速冷却至20-25℃离心去除鱼精蛋白等沉淀物，获得35L 含热变
性DNA 的溶液，经精确测定DNA 含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA 溶液中逐渐加入等体积95乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA 粗品，产品含热变性DNA50-60。（2）具有生物活性DNA 的制备脾、动物内脏肝、胸腺等加 4 倍重量生理盐水经组织捣碎机捣碎1min，匀浆于2500r/min离心30min，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3 次，每次洗后离心，将沉淀悬浮于20 倍重量的冷生理盐水中，再捣碎3min，加入 2 倍量含 5 用45％乙醇作溶剂十二烷基磺酸钠，预冷的95％乙醇，离心即可得到纤维状的DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。粗品DNA 溶于适量蒸馏水，加入5％十二烷基磺酸钠达1 / 10 体积，搅拌30min，经5000rpm 离心1h ，清液中加入NaCl 达1 mol/L，再缓慢加入冷95％乙醇，DNA 析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物活性的DNA。18.4.2 核苷酸的酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸可以从DNA 或RNA 经酶或化学降解的方法制备，也可以选育某种特定遗传性状的菌种经发酵法生产，从核苷经化学方法磷酸化生产核苷酸即半合成法也是工业生产的主要途径之一。1．酶解法及碱水解法制备核苷酸（1）酶解法制备5-单核苷酸单核苷酸在工业上已获得广泛应用，其中腺苷酸AMP用于生产ATP、辅酶A、辅酶Ⅰ，3，5-环腺苷酸和阿糖腺苷。胞苷酸CMP用于生产二磷胆碱、阿糖胞苷、聚肌胞。鸟苷酸GMP用于生产5-氟尿嘧啶核苷、阿糖尿苷，鸟苷酸钠是食品增鲜剂，也是抗病毒药物三氮唑核苷、无环鸟嘌呤的原料。我国从20 世纪60 年代开始使用核酸酶Pl 降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸肌苷酸和鸟苷酸3000 吨，其中60％是使用酶法生产的。酶解法制备5-单核苷酸的工艺流程见图18-2。↑↑↑↑ 图序号应该改正2 酶解法制备
脱氧核苷酸酶解法制备脱氧核苷酸的工艺流程见图18-3。↑↑↑↑ 图序号应该改正3双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸I G 呈味核苷酸的主要品
种是肌苷酸和鸟苷酸，商品名简称为I G ，用核酸酶Pl 降解RNA可获得AMP 和GMP，其中AMP 经脱氨生成IMP。双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸的工艺流程见图18-4。含有I G 的酶解液可应用阳离子交换树脂交换吸附，单核苷酸上柱量为 5 ，用去离子水洗脱，I G 集中在同一洗脱区段内，与UMP、CMP 及其它类核苷酸分开，含I G的洗脱液，经薄膜浓缩，冷却后，可以获得在水中结晶的I G 产品。↑↑↑↑ 图序号应该改正：图18-4 4菌体自溶法生产核苷酸磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA 可产生5-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌菌体自溶法生产5-核苷酸。①菌体自溶法生产核苷酸的工艺流程：离心自溶除盐谷氨酸发酵液—————→湿菌体—————→菌体自溶液———————————→无盐提取液pH10 用阳离子交换树脂调pH4.5-5.0 离心阳离子交换浓缩结晶———→清液——————→单核苷酸纯化液———→浓缩液———→结晶单核苷酸pH3.5 分离、纯化②自溶工艺流程操作要点：配制含纯碱0.2，小苏打0.1的pH10 水溶液，将溶液加热至70℃，在搅拌情况下缓慢加入谷氨酸湿菌体达3，60℃保温30min，加732 强酸性阳离子树脂控制pH4.5，停止搅拌让树脂沉降，取上层含菌体的溶液，加盐酸调pH3.5，冷处静置1h 沉降菌体上清液含5-核苷酸，用离子交换树脂层析分离方法同前述酶解法。自溶法可以综合利用味精厂的废弃菌体，但自溶所产生的5′-核苷酸浓度较低，一般仅为0.6mg/ml，总收率低。（5）碱水解法生产2，3-混合核苷酸用酶法降解RNA 得到的是5-核苷酸，对于生产呈味曙光考试
叉车技术核苷酸必须是5-端带有磷酸基团的5-IMP 和5-GMP。此外，还可利用RNA 结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定的特性，很容易生成2 ，3-混合核苷酸。取RNA 配成3％-5％的水溶液，加氢氧化钠达0.3mol/L 浓度，升温至38℃，保温16 一20h，用6mol / L 盐酸中和至pH7.0，使RNA 水解成2 ，3 -混合核苷酸的降解度达到95％以上，将2 ，3 -混合核苷酸制成每片含50-100mg 的片剂，经临床使用，对非特异性血小板减少症、白血球减少症、肿瘤的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。2．发酵法生产核苷酸（1）发酵法生产肌苷酸IMP 肌苷酸是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠味精中添加2 ，鲜度可以增加3 倍，因此在味精中添加肌苷酸钠或鸟苷酸钠后成为第二代特鲜味精。用发酵法生产肌苷酸在日本已工业化，年产量上千吨，发酵水平达到40-50g/L，对糖转化率达15％，总收率达80％。①产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌苷酸发酵机制产氨短杆菌嘌对呤核苷酸生物合成途径见图18-5。 5 -IMP 的生物合成来说，关键的酶是PRPP 即转酰胺酶，此酶受ATP、ADP、AMP 及GMP 反馈抑制抑制度达70％一100 ，被腺嘌呤阻遏。↑↑↑↑ 图序号应该改正：图18-5 因此利用产氨短杆菌直接发酵法生产肌苷酸，第一步是用诱变的方法筛选缺乏SAMP 合成酶的腺嘌呤缺陷型菌株，在发酵培养基中提供适量的腺嘌呤，这些腺嘌呤除了通过补救合成途径合成菌体适量生长所需的DNA 和RNA 之外，没有多余的嘌呤衍生物能够产生反馈抑制或阻遏，从而解除了PRPP 转酰胺酶的活性影响。此外，产氨短杆菌自身的5′- 核苷酸降解酶活力低，故产生的肌苷酸不会再被分解成其他产物。另一个涉及直接累积肌苷酸的重要因子是细胞的透性。虽然产氨短杆菌在正常生长状态下，其细胞膜对于5′- IMP 的透性是很差的，但只要在培养基中锰离子限量的情况下，产氨短杆菌的成长细胞呈伸长、默洛尼卫生洁具
膨润或不规则形，而此时的细胞膜不仅易于透过肌苷酸，且嘌呤核苷酸补救合成所需的几个酶和中间体核糖-5′-磷酸都很易透过，在胞外重新合成大量肌苷酸。为此日本学者提出了产氨短杆菌腺嘌呤缺陷菌株的肌苷酸发酵机制图18-6 ，在使用大型发酵罐的工业生产中，要把Mn2控制在10 一20μg/L 的浓度十分困难，因为工业原料和工业用水都含有较多的Mn2，为此，利用诱变育种的方法选育了对Mn2不敏感的变异株，使用发酵培养基含Mn2高达1000μg/L 时，肌苷酸的生物合成仍不受影响。↑↑↑↑ 图序号应该改正：图18-6 ②产氨短杆菌的诱变育种和肌苷酸累积由上文可知，直接发酵法生产肌苷酸的关键是要解除腺嘌呤衍生物的反馈抑制，使用腺嘌呤缺陷型菌株，提供亚适量的腺嘌呤培养基，改变细胞膜的透性，选育Mn2不敏感性变异株，经过诱变育种已得到能够符合上述条件的产氨短杆菌，并在工业生产上取得成效。（2）发酵法生产黄苷酸XMP及酶法转化鸟苷酸鸟苷酸是比肌苷酸钠更强的增鲜剂，它还是三氮唑核苷和无环鸟嘌呤的原料，因此在食品工业和制药工业中需求量很大。按照肌苷酸发酵生产机制，直接发酵生产鸟苷酸同样需要三个条件：解除GMP 的反馈抑制，改变细胞对GMP 的透性和不分解生成GMP。然而在产氨短杆菌的嘌呤核苷酸生物合成途径中，GMP 是位于合成途径的“终端产物”，缺乏磷酸化酶的生物体将不能合成RNA 和DNA。因此不可能到一种遗传性状能直接累积大量GMP的产氨短杆菌，大量的研究工作证实直接发酵产生GMP 的产量都很低，没有生产价值。黄苷酸XMP是鸟苷酸的前体产物，选育丧失GMP 合成酶的鸟嘌呤缺陷型菌株就可能积累大量黄苷酸，也可以再加上腺嘌呤缺陷型遗传标记，并在发酵过程中添加限量的鸟非常e购
嘌呤和腺嘌呤，完全解除鸟嘌呤对肌苷酸脱氢酶的反馈抑制和鸟嘌呤、腺嘌呤衍生物对PRPP 转酰胺酶的反馈抑制，从而使XMP 在发酵培养基中的累积大大提高。已培养选育了将黄苷酸转化成鸟苷酸的菌株，这类菌株及其发酵条件必须具备以下几点：① 5 -核苷酸分解能力微弱；②用抗生素强化GMP 合成酶特性；③在Mn2过量的培养基中需添加表面活活性剂改变其膜透性；④供给NH4维持培养基pH7 .cradle 2 the grave
5 一8 . 0。目前使用产生XMP 的菌株与将XMP 转化为GMP的菌株混合培养的方法，通过控制接种量调节二菌株的生产比例，可产生大量XMP 并能高效率地转化成GMP。GMP 的发酵产率在10g/L 左右。3．半合成法制备核苷酸由于发酵法生产核苷的产率很高，因此工业生产的呈味核苷酸肌苷酸钠和鸟苷酸钠估计有40％一50％的产量是由发酵法生产核苷后经提取、精制，再经磷酸化制取。目前工业生产使用的半合成方法是不保护核苷上的糖残基上的2 ，3 -羧基，直接在5 -羧基上磷酸化。也即将核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生产 5 -核苷酸收率达90。例一：肌苷2mmol/L 悬浮于5ml 磷酸三乙酯中，温度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol/L，水2mmol/L，反应2h，5 -IMP 摩尔产率达91。例二：鸟苷2mmol/L 悬浮于5ml 磷酸三乙酯中，温度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol/L，水2mmol/L，反应6h，5 -IMP 摩尔产率达90。18.4.3 核苷的化学法和发酵法制备生产核苷是多种核苷类药物的原料，这些药物通常是生物自身能够合成的组成遗传物质的结构类似物，目前已用于临床的此类药物有几十种，并且正在深入研究开发。在病
毒性疾病，提高机体免疫功能方面，核苷类药物有重要作用。1987 年 3 月美国食品药品监督管理局FDA批准使用的抗艾滋病药物AZT叠氮胸苷是全世界第一种被批准用于临床的艾滋病药，它是胸苷的衍生物。阿糖腺苷抗DNA 病毒，对脑膜炎、乙肝疗效显著，它由腺苷酸合成。5 -氟尿嘧啶、脱氧核苷以及5 -脱氧-5 -氟尿嘧啶核苷是消化道肿瘤及肝癌的疗效高毒性小的抗癌新药，由尿苷合成。此外，核苷的发酵法生产水平大大高于同类结构核酸的发酵水平，因此在食品工业上使用量很大的肌苷酸钠、鸟苷酸钠由肌苷和鸟苷经化学磷酸化法合成，ATP 由腺苷酯法合成。本节介绍核苷的化学法和发酵法生产。1.RNA 化学水解法制备核苷（1）核苷的化学水解法生产工艺流程常见的核苷的化学水解法生产工艺流程见图18-7。↑↑↑↑ 图序号应该改正：图18-7 2．发酵法生产核苷发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果，产率高、周期短、控制容易且产量高。日本味之素公司和武田制药厂发酵法生产核苷的产量上千吨，我国每年发酵法生产肌苷也达400-500 吨。用发酵法生产各种核苷的菌株有着许多共同特点：①它们都使用磷酸?ヵ?②酶活力很强的枯草芽抱杆菌或短小芽饱杆菌为诱变出发菌株；它们都是通过使用物理或化③学诱变方法选育出在遗传性状上具有特定标记的诱变菌；它们在发酵培养时必须提供限量的生长因素，并且好氧，在某一特定的范围内累积大量核苷。因此，我们首先应从枯草杆菌嘌呤核苷酸合成途径图18-8及代谢调控机制上探讨发酵法生产核苷菌种的选育。↑↑↑↑ 图序号应该改正：图18-8 在上述合成途径中，嘌呤核苷酸生物合成的第一个酶即PRPP 转酰胺酶受AMP、ADP 的强烈抑制，而受鸟嘌呤衍生物的抑制很弱。IMP 脱氢酶和SAMP 合成酶可分别受最终产物GMP 和AMP 的反馈抑制。因此，枯草杆菌的腺嘌呤缺陷型经诱变缺失
6 号或
7 号酶当培养基中提供限量腺嘌呤时，累积肌苷。由于鸟嘌呤衍生物强烈抑制IMP 脱氢酶，因此，枯草杆菌的
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