细胞粘附肽RGD 的液相合成的探究论文
精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸( Arg-Gly-Asp，RGD) 三肽是细胞粘附蛋白的识别位点，含有RGD 序列的多肽许多都具有抗粘附性能，可抑制肿瘤细胞与内皮细胞和基底膜的粘附，加速肿瘤细胞脱附，阻止肿瘤细胞滞留，从而抑制肿瘤细胞的转移。1984 年，Pierschbacher 等首次确定了RGD 序列为人纤维连接蛋白与其受体的结合位点。1985 年，Hayman 等将含RGD 序列的4 个寡肽与无RGD 序列的5 个寡肽进行细胞粘附活性研究，发现含RGD 序列的肽有抑制正大鼠肾、变异的鼠肾、鼠BALB /C373、人骨肉瘤( MG63) 和人纤维素瘤( HT1080) 细胞的粘附作用，而无RGD 序列的5 个肽则没有抗粘附活性。1987 年，Hynes报道，细胞表面存在与细胞粘附有关的ECM 糖蛋白受体，并将它们命名为整合蛋白。整合蛋白介导着许多种类的细胞与细胞及细胞与底物之间的相互作用，参与许多生物学过程，例如，体内平衡调节、吞噬作用、细胞迁移、细胞信号传递、淋巴细胞的识别、血小板的聚集等。由于许多病理学过程与正常的细胞外基质( ECM) 作用相关，含RGD 多肽或化合物有望用于某些疾病的。例如，将携带效应分子的RGD 肽与整合素αvβ3特异性结合，可以提高效应分子
的靶向性。因此，该类肽的类似物成为药物设计的一个新的靶点。综上所述，研究RGD 序列肽的合成具有重要意义。
在本文中，首先，采用一种新颖的化学法( 氨解取代法) 合成了二肽Gly-Asp，再利用N-羧基内酸酐法合成了游离RGD 三肽，这种化学合成肽的方法与传统上的化学法合成肽相比，具有高收率、低成本、合成量大的特点。樊字疗法
1 实验部分
1. 1 主要仪器与试剂
RE52 旋转蒸发仪( 上海亚荣生仪器厂) ; DHG-9070A 电热真空干燥箱( 上海精宏实验设备有限公司) ; Nicolet370 红外光谱仪( 美国Thermo 公司) ;LCMS-2010EV 液相质谱联用仪( 日本岛津公司) 。L-天冬氨酸( L-Asp) 、甘氨酸( Gly) 、Z-精氨酸( Z-Arg) ，购自上海晶纯化学公司; 乙酸乙酯、氯乙酰氯、氢氧化钠、无水乙醇、无水硫酸钠、四氢呋喃、三溴化磷、硼酸、四硼酸钾、正辛醇、氢氧化钾等均为市售国产分析纯试剂。
1. 2 实验方法blue time
首先，将氯乙酰氯和L-Asp 在弱碱性条件下反应，然后使用浓氨水取代氯，合成GD 二肽( Gly-Asp) ，再利用N-羧基内酸酐法合成游离RGD 三肽。 1. 2. 1 L-Asp 的氯乙酰化将4. 8g L-Asp 与8mL 质量分数为27%的氢氧化钠溶液混合，并调pH 在11 ～ 12 之间，再加入8mL 乙酸乙酯，于冰浴下搅拌。以相同的速度滴加5mL 氯乙酰氯和27%的NaOH 到上述溶液中，保持pH 在11 ～ 12之间。滴速不能太快，滴完后继续搅拌30min。结束反应后用浓盐酸调节pH = 1. 5，用乙酸乙酯萃取3 次，取上清液，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜。减压旋蒸除去乙酸乙酯，得到微黄油状物，静置过夜。油状物变为白粉末。 1. 2. 2 氯乙酰化的L-Asp 氨解称取所得的2. 0g 氯乙酰化L-Asp，加入12mL 浓氨水，冰浴下搅拌36h。减压旋蒸上述反应液，得到微黄的油状物。加乙醇振荡，除去醇溶物，出现微黄不溶物。加热旋蒸，得淡黄粉末。记为GD 二肽
1. 2. 3 NCA-Arg 的制备将5mL 四氢呋喃与3g ZArg在室温下激烈搅拌至完全溶解，加入5mL 三溴化磷与20mL 四氢呋喃的混合溶液。室温搅拌3h后，反应液未分层，旋蒸除去溶剂后，得到黄焦油状物，真空干燥过夜
1. 2. 4 N-羧基内酸酐法合成RGD 三肽取1. 9g GD 二肽溶于pH = 10 的50mL 硼酸四硼酸钾缓冲液体系( 0. 3g 硼酸+ 0. 1mol /L 50mL 四硼酸钾1. 53g) 中。用氢氧化钾调节pH 至10，加入1 滴辛醇，在激烈搅拌下一次加入一定量的NCAArg，并不断加入氢氧化钾保持pH = 10( 用pH 计监测) ，约5min，加入浓硫酸调pH 至5 终止反应。反应液旋蒸除去水后，冻干。用少量水溶解后用乙醇沉淀，得到白的粉末状固体。
1. 2. 5 产物的结构表征将待测样品溶于乙腈中，采用高效液相谱仪进行检测，采用5μm 的150mm × 4. 6mm 谱柱，流动相为V乙腈∶ V水=80∶ 20，以1. 0mL /min 的流速等度洗脱，上样量20μL，柱温为室温，检测波长λ = 220nm。
质谱检测时，流动相为乙腈，流速为0. 3mL /min，上样量5 μL。
农业部副部长李家洋 红外光谱检测时，在玛瑙研钵中，将待测样品与KBr 按1 ∶ 150 比例混合，研磨均匀，压成透明薄片。
2 结果与讨论
2. 1 氯乙酰化天冬氨酸的结构表征
实验制得白粉末状氯乙酰化天冬氨酸为6. 18g，产率约为82. 3%，经高效液相谱检测，其纯度为95. 2%。氯乙酰化天冬氨酸经质谱分析，正离子图谱中的[M + Na]+ = 231. 9，与理论值231. 57( 氯乙酰化天冬氨酸的理论分子量为208. 57) 吻合。
氯乙酰化天冬氨酸的红外光谱图见图2。3211. 7cm - 1处的吸收峰归属为羧基中O—H 的伸缩振动，2972. 4cm - 1 归属为饱和C—H 特征吸收峰，1692. 7cm - 1归属为羧基中C = O 的特征吸收峰，1564. 4cm - 1归属为酰胺键的特征吸收峰。
在反应过程中，天冬氨酸的氨基在弱碱性条件下可以与氯乙酰化试剂发生反应，生成氯乙酰化天冬氨酸。此反应需在冰浴下进行，若温度太高，副反应多; 若pH 降低，也会有副产物生成。本实验选用水和有机相的混合溶剂，不仅可以减少水解副反应的发生，还可使生成的`产物转移到有机相，促进反应发生。
2. 2 GD 二肽的结构表征
实验制得淡黄粉末状GD 二肽为1. 55g，产率约为84. 8%。经高效液相谱检测，其纯度为98. 6%。GD 二肽的高效液相谱图。
蜂窝煤 经质谱分析，GD 二肽的理论分子量是190. 07，[M + H]+ = 191. 07，所合成的样品的正离子图谱中的[M + H]+ = 191. 1 与理论值一致。GD 二肽红外分析结果所示，在3450. 3 和3370. 4 cm - 1 出现的双峰，归属为氨基的特征吸收峰，1690. 7cm - 1 的峰归属为羧基中C 匫的特征吸收峰，1619. 0cm - 1处是酰胺键的特征吸收峰。
在氯乙酰化天冬氨酸氨解生成二肽的过程中二肽可能与多余的氨水发生副反应，太短反应不完全，太长副反应多，所以反应时间取为36h。反应后要立即旋蒸除去氨气。由于反应放热，低温有利于产物产率的提高，所以也需在冰浴下反应。
2. 3 RGD 三肽的结构表征
实验制得白粉末状RGD 三肽为2. 47g，产率约为71. 4%。经高效液相谱检测，其纯度为94. 2%。
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RGD 三肽的质谱分析的正离子图谱中的[M+ H]+ = 346. 1，与理论值[M + H]+ = 346. 3( RGD 三肽的理论分子量为345. 3) 吻合。RGD 三肽的红外分析结果，其中，3420. 3cm - 1 的峰归属为氨基的特征吸收峰，1674. 9 和1619. 0 cm - 1 的峰分别归属为羧基中匔=O 和精氨酸中胍基 C=N 的特征吸收峰。什么是经济新闻
RGD 三肽合成中，应该注意以下两点: 第一，在NCA-Arg 的制备中，控制催化剂溶液的温度非常重要，一定要保持催化剂溶液温度在0℃以下，因为三溴化磷( PBr3) 具有挥发性，温度升高会使三溴化磷挥发，而失去催化活性; 第二，在RGD 三肽的合成中，需控制反应在低温条件下进行。已经知道，N-羧基在0℃下稳定，在室温下则易于分解放出CO2; 此外低温有利于氨解反应而不利于NCA 的水解和形成NCA 负离子。另外，需严格控制反应在pH = 10 下进行，pH 过低会使N-羧基脱羧而同NCA 反应造成酸催化; 但pH 过高，不仅会使NCA 发生水解，而且还会导致通过形成NCA 负离子而发生的碱催化过头或形成尿素衍生物。采用高速搅拌使反应物能够快速地均匀混合，因为在反应过程中，会有少量NCA 负离子存在，如搅拌速度较慢，会造成NCA 周围的氨基酸浓度较小，从而导致NCA 同NCA 负离子反应产生副产物。
3 结论
随着RGD 肽类药物的广泛应用和深入研究，有关RGD 肽类的合成越来越显示其重要性和潜在的市场价值。本文使用液相合成法成功合成出RGD 三肽。首先以天冬氨酸为原料在pH = 11 ～12 之间、冰浴条件下进行氯乙酰化，得到中间产物，然后在冰浴条件下与25%
～ 28% 氨水进行氨解反应，得到GD 二肽，最后利用NCA 法合成三肽。此方法具有高收率、低成本、合成规模大的特点。
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