天津医药2021年9月第49卷第9期
耿红娟1，袁洋2，尼娜1△
摘要：目的风中的铃铛
探讨化学合成肽修饰钛种植体表面的抗菌效果。方法
利用源于人类β防御素3（hBD3）的一个片
段（hBD3-1）与肽TBP-1化学结合，形成合成肽TBP-1-hBD3-1。Peptide Calculator 软件分析合成肽的基本性质；标准微量肉汤稀释法检测TBP-1-hBD3-1对牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis ）的最小抑菌浓度（MIC ）、最小杀菌浓度（MBC ），微量滴定法检测生物膜对照组和生物膜实验组光密度（OD 600）值差异；共聚焦激光扫描显微镜（CLSM ）检测TBP-1-hBD3-1修饰在钛种植体表面的黏附、活性情况。结果TBP-1-hBD3-1具有较好的溶解性及亲水性，并有疏水性基团，带有一定的正电荷数（4+）。TBP-1-hBD3-1对P.gingivalis 的MIC 值和MBC 值分别为400mg/L 和1000mg/L 。
生物膜实验组较生物膜对照组OD 600值降低（P ＜0.05）。CLSM 结果表明，被AMC 标记成蓝的TB
P-1-hBD3-1能够牢固地黏附于钛样本表面。结论合成肽TBP-1-hBD3-1能够修饰在钛样本表面并发挥抗菌和抑制细菌生物膜形 成的作用。
硝烟岁月关键词：牙种植体；植入物周围炎；牙髓卟啉单胞菌；β防御素；显微镜检查，共焦；合成肽；钛表面改性；抗菌肽中图分类号：R783.1
文献标志码：A
DOI ：10.11958/20211015
Study on the antibacterial effect of chemically synthesized peptides on the surface of titanium implants
GENG Hong-juan 1,YUAN Yang 2,NI Na 1△
1Department of Stomatology,Tianjin Hospital,Tianjin 300211,China;2Department of Stomatology,
Tianjin Medical University General Hospital
护理学基础精品课程
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Corresponding Author E-mail:nina_tj@163
Abstact:Objective To explore the bacteriological effects of chemically synthesized peptides on the surface of
titanium implants.Methods
A fragment (hBD3-1)derived from human βdefensin 3(hBD3)was chemically combined
with peptide TBP-1to form synthetic peptide TBP-1-hBD3-1.Peptide Calculator software was used to analyze the basic properties of synthetic peptides.The standard micro broth dilution method was used to detect the minimum inhibitory concentration (MIC)and the minimum bactericidal concentration (MBC)of TBP-1-hBD3-1.The microtitration method was
used to detect the difference of optical density (OD 600)between biofilm control group and biofilm experimental group.Confocal laser scanning microscope (CLSM)experiments was used to further test the bacterial adhesion and bacterial activity on the surface of titanium implants.Results
TBP-1-hBD3-1showed good solubility,hydrophilicity and hydrophobicity,
and had a certain number of positive charges (+4).The MIC and MBC values of TBP-1-hBD3-1to P.gingivalis were 400mg/L and 1000mg/L,respectively.The OD 600value was significantly lower in the biofilm experimental group than that of the biofilm control group (P ＜0.05).The results of CLSM showed that the TBP-1-hBD3-1labeled blue by AMC could be
modified on the surface of titanium plate and exerted antibacterial effect.Conclusion The synthetic peptide TBP-1-hBD3-1can be modified on the surface of titanium samples and play an antibacterial and biofilm inhibition effects.
Key words:dental implants;peri-implantitis;Porphyromonas endodontalis;beta-defensins;microscopy,confocal;
synthetic peptide;surface modification of titanium;antimicrobial peptide水产品包装设计
作者单位：1天津市天津医院口腔科（邮编300211）；2天津医科大学总医院口腔科
作者简介：耿红娟（1986），女，博士，主治医师，主要从事牙种植体周围炎方面研究。E-mail ：juandreams@163
△
通信作者E-mail ：nina_tj@163
目前，口腔种植技术因成功率、存活率高，已成为牙列缺失或缺损中不可或缺的修复方法。然而，口腔种植体周围炎的发生率较高。种植体周围炎是一种不可逆转的炎症病变，可引起种植体松动、
脱落等渐进性骨破坏，最终导致失败［1］。因此，抑制种植体周围炎是降低种植修复失败率的关键。
实验研究
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Tianjin Med J,September2021,Vol.49No.9
目前，对种植体表面进行改性，获得具有生物功能活性的种植体表面是减少种植体周围炎发生的重要手段之一，也是牙齿种植修复领域研究的热点［2-3］。近年来，抗生素的滥用造成了细菌耐药性的增强，进一步增加了种植体周围炎的发生概率，而抗菌肽为一种不易致细菌产生耐药性的新型抗菌剂，受到广泛关注［4-5］。本研究利用源于人类β防御素3（human
β-defensin-3，hBD3）的序列片段（hBD3-1）对种植体表面进行改性，观察其能否抑制细菌生物膜形成，降低种植体周围炎发生率，以期为临床提供参考。1材料与方法
1.1主要仪器与试剂KM-12C超声波清洗器（广州市科盟实验仪器有限公司）；美普达UV-3300B紫外分光光度计（深圳中科先创科技有限公司）；Synergy HT酶标仪（美国BioTek 公司）；KS160A-2二氧化碳培养箱（上海冠森生物科技有限公司）；低速高温离心机（德国EPPENDORF公司）。结合肽（TBP-1）和化学合成肽（TBP-1-hBD3-1）购自上海淘普生物科技股份有限公司；冰乙酸、无水乙醇、无菌去离子水、磷酸盐缓冲液（PBS）、96孔板、比皿购自上海生工生物工程股份有限公司；脑心浸液肉汤培养基、脑心浸液琼脂培养基购自北京索莱宝科技有限公司；牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）购自美国模式菌种收集中心。
1.2钛片样本制作将钛片切割成直径10mm、厚度0.5mm 的圆形样本100个，并依次使用100、240、400、600、800、1000及1200目的砂纸打磨，再依次用丙酮、乙醇和蒸馏水对各样本进行超声清洗各30min，经室温干燥、备用。
1.3TBP-1-hBD3-1制备委托上海淘普生物科技股份有限公司，将hBD3-1与结合肽（Ti-binding peptide-l，TBP-1）合成TBP-1-hBD3-1。质谱分析法对TBP-1-hBD3-1进行纯度检测（纯度＞95%），高效液相谱分析法对TBP-1-hBD3-1的特性进行检测。通过Peptide Calculator软件分析TB
P-1-hBD3-1的基本性质。将TBP-1-hBD3-1作为溶质溶解于PBS中，并配置成100、200、400、800、1000及2000mg/L的抗菌肽溶液，备用。
1.4TBP-1-hBD3-1抗菌特性的检测
1.4.1标准微量肉汤稀释法检测TBP-1-hBD3-1的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）100μL的P.gingivalis 菌悬液（5×105CFU/mL）与相同体积的无菌PBS混合作为对照组；100μL菌悬液（5×105CFU/mL）再分别与等体积的不同剂量（100、200、400、800、1000及2000mg/L）的TBP-1-hBD3-1溶液混合为实验组；每组设3个复孔，接种于96孔板，置于37℃的恒温培养箱内，在厌氧的条件下（80%N2、10%CO2、10%H2）培养48h。将完全抑制细菌生长的最小TBP-1-hBD3-1溶液浓度作为TBP-1-hBD3-1的MIC，并以此浓度为基础配成≥MIC值的抗菌肽浓度，99.9%的细菌被杀死时的抗菌肽浓度即为MBC值。实验重复3次。
1.4.2微量滴定法检测TBP-1-hBD3-1作用于P.gingivalis 的生物膜实验将100μL P.gingivalis的菌悬液分别接种于
含有100μL的PBS（生物膜对照组）和100μL的400mg/L的TBP-1-hBD3-1溶液（生物膜实验组）的96孔板中，每组设3个复孔；置于37℃的培养箱（80%N2、10%CO2、10%H2）中培养72h；室温下烘干20min；95%甲醇固定，0.5%结晶紫染，95%乙醇脱，用酶标仪分析生物膜波长600nm处的光
密度（OD600）值。实验重复3次。
1.4.3共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察TBP-1-hBD3-1黏附和细菌活性情况用7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）标记TBP-1-hBD3-1（呈蓝），以便观察TBP-1-hBD3-1是否吸附在钛片样本表面。无TBP-1-hBD3-1处理的空白钛片样本为CLSM对照组；取无菌的钛片浸入1.4.1实验所得MIC TBP-1-hBD3-1溶液内，在4℃环境下静置2h（CLSM实验组）备用。取1mL的P.gingivalis（5×105CFU/mL）菌悬液置于含有2组样本的24孔板内，37℃培养箱内培养24h。用经灭菌处理后的PBS缓慢冲洗样本，将未黏附于表面的细菌去除，再置于未使用过的24孔板内，用AO/EB染剂染，CLSM观察样本表面细菌黏附和细菌活性情况。每组实验3次。
1.5统计学方法采用SPSS19.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（x±s）进行表示，2组间比较用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1TBP-1-hBD3-1的分子特征Peptide Calculator 软件分析结果显示，TBP-1-hBD3-1具有较好的溶解性及亲水性，并有疏水性基团，带有一定的正电荷数（4+），见图1。
2.2TBP-1-hBD3-1的MIC、MBC及生物膜实验结果TBP-1-hBD3-1对P.gingivalis的MIC值和MBC 值分
别为400mg/L和1000mg/L。与生物膜对照组OD600值（1.045±0.063）比较，生物膜实验组（0.540±0.046）明显降低（n=3，t=1
3.413，P＜0.05）。晋江实验小学
2.3TBP-1-hBD3-1吸附情况CLSM对照组可见绿的活菌覆盖整个钛样本表面，CLSM实验组可见红的死菌覆盖了大部分钛样本表面，并可见蓝的TBP-1-hBD3-1紧密黏附于钛样本表面，见图2
。
顶部：亲水性；底部：疏水性
Fig.1Molecular characteristics of synthetic peptides
图1TBP-1-hBD3-1的分子特征
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3讨论
牙种植修复失败的原因之一为种植体周围炎，而细菌生物膜的形成又是种植体周围炎的重要诱发因素［6］。目前，改变钛种植体表面性质、抑制细菌生物膜的形成和促进骨结合是降低牙种植失败率的一个重要策略［2-3］。研究表明，hBD3具有抗真菌、抗细菌、抗病毒等多种活性，细胞毒性较小，不易降解，对金黄葡萄球菌也同样具有抗菌活性［7］。因此，
hBD3有望作为抗菌药物而应用于临床，但其分子质量较大，成本较高。研究显示，hBD3-1序列片段具有抗炎和穿透细胞膜的特性［8］。另有研究显示，TBP-1可直接吸附在钛材料表面［9］；抗菌肽可随着所带正电核数的增加而增强其抗菌活性［10］；与无两亲性结构的抗菌肽比较，具有两亲性结
构的抗菌肽在与靶膜作用时表现出更强的抗菌活性［11］。Peptide Calculator软件分析结果显示，本研究中制备的TBP-1-hBD3-1具有优良的溶解性、亲水性，带有疏水性基团，并带有正电荷数（4+），表明TBP-1-hBD3-1具有与抗菌相关的理化参数。MIC和MBC结果表明，TBP-1-hBD3-1对浮游状态下的P.gingivalis 具有一定的抗菌活性。
种植体表面细菌生物膜的形成是导致种植体周围炎的主要生物学因素。本研究结果显示，与生物膜实验对照组相比较，TBP-1-hBD3-1作用于P.gingivalis生物膜72h后表现出抗生物膜的特性，而CLSM结果显示，CLSM对照组可见绿的活菌覆盖整个样本表面，CLSM实验组可见红的死菌覆盖了大部分样本表面并可见蓝的TBP-1-hBD3-1仍然紧密地附着于样本表面，证实了TBP-1-hBD3-1既能够修饰钛材料表面，又能发挥抑制细菌和抗细菌生物膜形成的作用，考虑其机制可能与其具有亲水性和疏水性基团，带有正电荷数（4+）有关。
综上所述，TBP-1-hBD3-1能够对钛种植体表面进行修饰，形成具有抗菌活性的种植体表面，并减少或抑制种植体表面细菌生物膜的形成，从而有可能用于临床来降低种植体周围炎的发生。然而，在口腔种植体表面，细菌生物膜的形成是由多种细菌参与完成。在本研究的抗菌活性实验中只是针对具有代表性的单一菌种P.gingivalis，TBP-1-hBD3-1是否对其他细菌也具有抗菌作用以及其生物相容性如何，有待后续研究验证。
参考文献
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乡村医生从业管理条例（2021-04-26收稿2021-06-04修回）
（本文编辑陆荣展）
CLSM对照组CLSM实验组
绿：活菌；红：死菌；蓝：TBP-1-hBD3-1
Fig.2The adsorption of TBP-1-hBD3-1observed by confocal laser
scanning microscope(AO/EB staining)
图2共聚焦激光扫描显微镜观察TBP-1-hBD3-1吸附
情况（AO/EB染）
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