文章编号: 100820872 (1999) 0420257206
神经肽Y Y 1 受体是背根节神经元的胞体受体和脊髓背角 神经元的连接后和突触后受体
林英华, 童永光, 鲍岚, 张旭劳动价值论
(第四军医大学中国人民解放军神经科学研究所, 西安710032)
摘要: 用间接免疫荧光方法, 将神经肽Y Y 1受体免疫反应物质(L I) 定位于大鼠腰段背根节小神经元和脊髓层神经元近细胞膜处。用共聚焦显微术显示背根神经元中Y 1受体2L I 呈点状分布于神经元表面。在电子显¦
微镜下发现Y1 受体2L I 主要定位于背根节小神经元细胞膜下被膜囊泡、内在小体和管状池, 有时也定位于细胞膜上。在脊髓¦
层中, Y 1受体2L I 定位于神经元细胞膜, 许多树突为Y 1受体阳性, 与未被标记的轴突终末形成突触; Y 1受体2L I 主要定位于突触后膜以外的细胞膜, 只有在少数情况下定位在突触后膜。表明在大鼠背根节小神经元中Y 1受体为胞体受体, 并参与受体内在化过程; 在脊髓背角神经元中, Y 1受体是连接后ƒ突触后受体。
关键词：神经肽Y; Y
1 受体; 脊髓; 背根节
中图分类号:R 322181 文献标识码: A
NEUR O P EPT I D E Y Y 1 RECEPT O R I S A S OM A T I C RE-CEPT O R O N DO RSAL R OO T GA N G L I O N NEUR O NS A N D PO S TJUNCT I O N AL ƒPO STSY NA P T I C RECEPT O R O N A批林批孔
DO R SAL H O R N NEUR O N S
L I N Y i n g2h u a, TON G Yo n g2gu a n g, BA O L an ,ZHA N G X u
( I n s t i tu te of N eu rosc i en ce of PL A , 4th M il i ta ry M ed ica l U n iv e r s i ty , X i’an 710032)
A bstra c t:
B y u sin g th e in d i rec t i m m uno f l uo re s cen ce m e t ho d, n eu rop e p t i de Y Y 1recep to r2lik e i m m uno re2 ac t i v i ty (L I) w a s lo c a l ized c l o se to th e p la s m a l em m a o f s m a l l n eu ro n s in lu m ba r do r s a l roo t gan g l ia (D R G s)
o f th e lu m ba r sp in a l co rd. Y 1recep to r2L I w a s v i sua l ized in D R G n eu ro n s a s m an y an d o f n eu ro n s in lam in a ¦
do t2lik e st r uc t u re s o n th e su rface by co n fo c a l m ic r o scop y. U n de r th e e l ec t r o n m ic r o scop e, th e s e st r uc t u re s w e r e revea l ed to be com p o sed o f co a t ed ve s ic l e s, en do som e s an d tub u la r c i ste r n ae, som e t i m e s in th e p l a s2
o f th e sp in a l co rd. m a l em m a. Y 1recep to r2L I w a s lo c a lized in th e p la s m a l em m a o f th e n eu ro n s in lam i n a ¦
M an y den d r i te s w e r e Y 1recep to r2po sit i ve an d som e o f th e m m ade syn ap t i c co n t ac t s w ith un sta i n ed axo n a l te r2 m in a l s. Y 1recep to r2L I w a s m a in ly l o c a l ized in th e m em b ran e o u t s ide th e p o st s yn ap t i c den sity; how eve r, in a 收稿日期: 1998211203 修回日期: 1999201213
基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 39525010, 39830160)
作者简介: 林英华( 19552), 女, 山东文登人, 第四军医大学中国人民解放军神经科学研究所实验师, 长期从事电镜及免疫组化工作1
视在功率
few ca s e s th e labe l in g w a s seen in th is zo n e. T h e da t a show th a t in th e ra t th e Y 1recep to r is a som a t i c recep 2 to r o n s m a l l D R G n eu ro n s an d is in vo lved in recep to r in te r n a l iza t i o n p ro c e s se s.In th e sp in a l do r s a l ho rn th e Y 1recep to r is a po st j un c t i o n a lƒpo st s yn ap t i c recep to r o n lam in a ¦
n eu ro n s.
Key word s: n eu rop e p t i de Y; Y
1recep to r;sp in a l co rd; do r s a l roo t gan g l i o n
神经肽Y (N P Y) 是一种首先从牛脑中分离出的多肽1 , 并被分子克隆2 , 在中枢及外周系统中起重要作用。N P Y 受体被分为多种亚型3 , 其中两种主要的受体亚型为Y 1 和Y 2 受体。Y 1 受体代表一种连接后受体, Y 2受体是一种连接前受体。Y1受体4 、4 ℃孵育24 h 后, 入导硫氰酸荧光素(F I T C)标记的驴抗兔IgG ( 1: 40 ) (J a ck so n I m m uno R e s ea r ch , W e s t G r p o v e, PA , U S A ) 中37 ℃孵育30 m in ，用含0101% 对苯二胺的甘油ƒPB S( 9: 1) 封片, 荧光显微镜观察。
112 共聚焦显微镜用B I O2RA K M R C2600 激光扫描共聚焦显微镜对部分背根节和脊髓切片进行分析。将选定的Y 1受体阳性D R G ( d o r s a l roo t gan2 g l i o n)细胞扫描成1 Λm 厚的系列连续光学切 片, 分析每一个光学切片, 再将这一系列切片按不同间隔叠加进行分析, 并对细胞由上表面至底部进行分析。
Y 2受体5以及其它一些亚型均已被克隆。
许多研究表明N P Y在脊髓水平具有一定功能, 在脊髓背角浅层中有高密度的N P Y2免疫反应性( Ir) 神经元和纤维6 。在大鼠背根节中Y 1 受体在含有降钙素基因相关肽(C GR P ) 的小神经元表达7 , 主要分布于胞体细胞膜附近, 很少被运输至脊髓后角浅层中的传入纤维终末。
近来, 对G2蛋白偶联受体的细胞内在化及再循环过程分析倍受关注, 涉及的受体如神经激肽(N K 1) 受体8 ～10 , Β2肾上腺素受体和促胃酸激素释放肽受体11 。在我们最初的免疫荧光标记和激光共聚焦显微分析中观察到大鼠背根节神经元中Y 1受体2L I 显斑点样形式分布在胞体膜附近, 然而, 即使用共聚焦显微术也没能获得有关受体定位的确切资料。本研究使用激光共聚焦显微镜技术及免疫电镜技术对Y 1受体在背根节神经元表面的定位进行了更细致的研究。大鼠脊髓¦
层的局部神经元也表达Y 1受体, 尤其是¦
层深部的神经元, 同时有大量的神经纤维分布7 。因此, 实验的另一目的是研究脊髓¦
层中Y 1受体2L I 在亚细胞水平的分布特征。113 免疫电镜将3 只雄性S D 大鼠( 200～250 g)腹腔注
称赞教学设计射钠(60 m gƒk g) 麻醉。经心脏灌注37 ℃生理盐水50 m l, 继灌注37 ℃4% 多聚甲醛、011% 戊二醛和012% 的011 m o lƒL PB (p H 714) 50 m l, 接着灌注4 ℃同种固定液500 m l。取脊髓腰4、5 段和腰4、5 背根节, 4 ℃下同种固定液后固定215～3 h。做50 Λm 厚的脊髓及背根节振动切片, 入20% 蔗糖液中3 h 后, 液氮冻融处理。切片在兔抗Y 1受体抗体(1: 2 000) 7 中4 ℃孵育48 h 后，入胶体金标记的山羊抗兔免疫球蛋白( 胶体金直径114 nm ; 1: 100; N anop ro b e s In c, S t o n y B roo k, N Y ,U S )室温孵育2 h 后, 用1% 戊二醛固定15 m in。切片用去离子水清洗后, 在暗室中用银加强液(HQ S ilve r T M , N anop ro be s) 加强4～6 m in , 用去离子水及011 m o lƒL PB 冲洗, 1% 中固定30 m in。切片用Ep o n812 平板包埋, 聚合后, 在光学显微镜下定位, 取有Y 1 受体2L r 神经元的脊髓背角浅层和D R G 组织, 粘于树脂块上。超薄切片机切片, 乙酸双氧铀和枸橼酸铅染, 电镜观察。
114 免疫组化对照实验利用制备抗体的人工合成的Y 1受体肽段7 , 进行预吸收实验, 检测Y 1受体
抗体的特异性。合成肽的反应浓度为10- 6 m o lƒL , 反应温度4 ℃, 反应时间24 h , 用预吸收后的抗体做免疫组织化学反应。
1 材料与方法
111 免疫荧光组织化学S D 大鼠4 只, 腹腔注射钠(60 m gƒk g) 麻醉, 经心脏灌注37 ℃生理
盐水50 m l, 继灌注37 ℃4% 多聚甲醛和012% 的0116 m o lƒL 磷酸缓冲液(PB , p H 619) 50 m l, 接着灌注4 ℃同种固定液400 m l。取腰4、5 背根节和脊髓置于4 ℃同种固定液后固定90 m in 后, 入10% 蔗糖液24 h。用恒冷箱切片机做厚度为14 Λm 的连续切片。切片在兔抗Y 1受体抗体P (1: 2 000) 7
2 结果
211 背根节在大鼠腰4、5 背根节中有2314% 的神经元含Y 1 受体2L I, 这些Y 1 受体2Ir 神经元为小神经元。普通荧光显微镜下免疫反应物质主要位于核周围胞浆中和胞体的细胞膜附近。用激光共聚焦显微镜观察Y1 受体2Ir 神经元(F ig 1a) , 并做系列光学切片(约1 Λm 厚)。当把系列光学切片叠加后, 在胞浆中可以观察到较弱标记的同时, 还观察到许多强Y 1受体2Ir 的斑点结构(F ig 1c) , 以细胞膜附近为多。由细胞上表面到底部对细胞的每一张光学切片进行分析, 在细胞上、下表面的光学切片中, 这些免疫反应阳性的斑点状结构位于细胞表面(F ig 1d )；细胞中部的光学切片显示, Y 1受体2Ir 斑点状结构定位于接近细胞表面的地方, 仅极少数位于胞浆深处(F ig 1e)。弱的Y 1受体2L I 相对集中在核周区域(F ig 1e)。
F ig 1 Co nf o c a l m ic r o g rap h s o f Y1 recep to r2L I in L 5 D R
G s (a, c～e) and do r sa l ho rn o f L 5 sp ina l c o rd ( b). O p t i ca l sec t io n s
o f th e cen te r o f neu r o n s o f D R G (a) and sp ina l do r sa l ho rn (b ) show h igh leve ls o f Y1 recep to r2L I o n th e su rface o f th e ce lls ( a r r ow h ead s). F luo re scen t p unc ta a r o und th e Y 1 recep to r2po sit ive neu r o n s a re dend r it ic p r o c e sse s ( b ). ( a ～e) Co nf o ca l m ic r o g rap h s show m e rged op t ica l sec t i o n s a t 1 Λm in te rva ls (c) and sing le op t ica l sec t i o n th r o ugh th e top (d) and cen te r (e) o f a Y1 recep to r2po sit ive D R G neu r o n s. (c) M e rg ing o f12 op t ica l sec t io n s show s th a t Y1 re2 cep to r2po sit ive, do t2lik e st ruc tu re s app a ren t ly a re lo c a ted o n th e ce ll su rface and in side th e cy top la sm (a r r ow h ead s).
H ow eve r, th e f ir st op t ica l sec t io n (d) and th e sec t i o n s th r o ugh th e cen te r o f th e ce ll show th a t th e po s it i ve do t2lik e
st ruc tu re s a re ac t ua l ly o n th e su rface o f th e ce ll. B a r s ind ica te 10 Λm in a and b , 5 Λm in c～e
当用包埋前免疫金标记和银加强技术, 在背根节小神经元中观察到金2银颗粒标记在核周区域的粗面内质网和高尔基器的池膜上。从高尔基器到细胞膜下, Y 1 受体2L I 呈弥散状分布于胞浆中, 没有观察到Y 1 受体2Ir 的特定结构。通常沿细胞膜可观察到Y 1 受体2L I 有两种分布形式, 第一种是较弱的Y 1 受体2L I 标记, 定位在细胞膜的平滑部分( F i g2a、d ) ; 第二种以高密度金2银颗粒标记为特征, 分布在
细胞膜有折叠和内化结构区域, 这些结构包括: ①被膜囊泡, 金2银颗粒不仅分布于囊泡膜上, 也分布于其内部(F ig 2a) ; ②内在小体, 在胞浆中近细胞表面处, 经常可以看到被膜囊泡和无被膜囊泡融合形成内在小体, 具有电子密度较高的基质, 金2银颗粒可分布在内在小体膜上及内部(F ig 2a、b ) ; ③管状池, Y 1 受体2Ir 管状池经常可在近细胞膜处观察到, 并具有低电子密度的基质, Y 1 受体2L I 主要在管状池膜上(F ig 2c、d) , 靠近管状池的细胞膜有时发生折叠并与之相连, 一些金2银颗粒就分布在附近的细胞膜上(F ig 2d) ; ④多泡体和溶酶体, 在一些与管状池相连的多泡体表面观察到Y 1 受体2L I(F ig 2d) , 但仅偶尔在多泡体内看到, 有时在管状结构附近可看到溶酶体(F ig 2d) , 但金2银颗粒极少位于溶酶体内。
o f L 5 sp ina l c o rd, p r o 2 F ig 2 E lec t r o n m ic r o g rap h s o f Y1 recep to r2L I in D R G neu r o n s ( a～d) and in th e inne r la m ina ¦
ce ssed f o r i mm uno go ld labe ling and silve r enh ance m en t ( a～d, f, g ) o r i mm unop e r o x ida se m e tho d( e ). ( a ) T h e go ld2silve r labe l ing f o r Y1 recep to r2L I is a sso c ia t ed w ith a c o a ted ve sic le (a r r ow ) budd ing o ff f rom th e p la sm a le mm a
(a r row h ead s). I n se t show s h igh m agn if ica t io n. (b )I n th e cy top la s m nea r th e ce ll su rf ace ( a r row h e ad s) , Y 1 re2
ce tpo r2L I is lo ca l ized in side and o n th e su rface o f endo som e s (a r row ). ( c) S t r o ng labe ling f o r Y1 recep to r2L I in th e m e m b rane o f tubu la r c iste rnae (a r r ow s) is c o nnec ted to th e p la sm a l e mm a (a r r ow h ead s). ( d) T h ree in ten se ly labe led reg io n s ( a r r ow s) a re a sso c ia t ed w ith tubu la r c iste r nae, ly so som e ( 1) and endo som e ( 2) unde rnea th th e p la s m a le m 2 m a (a r row h ead s). ( e) A w eak ly labe led cen t ra l te r m ina l m ak e s synap t ic c o n tac t w ith tw o Y1 recep to r2po sit i ve de n2
d r it
e s (d1 and d2 ) and a Y1 recep to r2nega t ive o ne (d3 )
f o r m in打印机共享器
g o f g lom e ru lu s. (f) T
h e cen t ra l te r m
i na l o f a
g lom e ru l u s is w eak ly labe led (a r r ow h ead) , and th ree dend r ite s a re po sit ive f o r Y1 recep to r. Y1 recep to r labe ling is
lo ca lized no t o n l y o u t side th e po st s ynap t ic m e m b rane, bu t a lso w ith in th e po st s ynap t ic m e m b rane ( a r row ). ( g ) Y1 recep to r2L I is seen a lo ng th e p la sm a le mm a ( a r r ow h e ad s) o f th e neu r o n s in la m ina ¦
o f th e sp ina l c o rd, bu t no t in
th e po st s ynap t i c m e m b rane (a r r ow s). B a r s ind ica t e 200 nm in a l l p ic tu re s
212 脊髓背角 在脊髓¦ 层中的许多神经元胞体
和突起上观察到 Y 1 受体2L I , 其中以¦ 层深部密度 最高。激光共聚焦显微镜下观察到 Y 1 受体2L I 分布 于神经元胞体细胞膜和细胞体周围的大多数突起上 (F ig 1b )。
反打镜头
当用包埋前免疫金2银加强技术来分析¦ 层内
Y 1 受体2Ir 的亚细胞定位时, 观察到在脊髓¦
层深 部可看见许多 Y 1 受体2Ir 树突, 而且它们经常与轴 突终末发生突触连接 (F ig 2e 、f )。 金2银颗粒标记主 要分布在突触后致密区以外的细胞膜上 (F ig 2f )。除 了在极少量突触球的初级传入终末有非常弱的标记 以外, 没有发现 Y 1 受体阳性的轴突终末。 在一些突 触球中, 1～ 3 个树突具有 Y 1 受体2Ir (F ig 2e 、f ) , 金2 银颗粒不仅分布在突触后膜以外, 有时也分布在突 触后膜区域 (F ig 2f )。Y 1 受体2Ir 神经元的细胞核多 呈椭圆形, 胞浆较少 (F ig 2g ) , 在细胞膜上有高密度 标记, 常有 Y 1 受体免疫反应阴性的轴突终末与 Y 1 受体2Ir 神经元有连接, 但这种连接的突触后膜上没 有 Y 1 受体标记 (F ig 2)。
213 免疫组化对照实验 用抗原预吸收后的 Y 1 受
体抗体做免疫组织化学实验, 没有观察到上述任何
免疫荧光或免疫金2银颗粒的标记。
构, 这样的分布特征与以往观察到的特异性配体分 别作用于促胃酸激素释放肽受体10 、N K 1 受体8 ～ 10 和 Β22肾上腺素受体12 后发生受体内在化, 并进入
早期内在小体的现象十分相似。显然, 根据由许多光
学切片叠加后的影像观察到 Y 1 受体2Ir 斑点定位于 远离质膜的胞浆内是不精确的。 由单个光学切片或 少数光学切片相结合揭示所有阳性斑点或多或少在 质膜附近, 同时表明 Y 1 受体由高尔基体向邻近细胞 膜的运输过程很难用共聚焦显微镜观察到。 涉及 G 蛋白偶联受体的内在化及与功能的关系的超微结构 研 究 很 少14 , 其 研 究 主 要 是 运 用 共 聚 焦 显 微 镜 技 术。本文对背根节神经元中 Y 1 受体2L I 的研究结果 表明 Y 1 受体2L I 标记主要定位于被膜囊泡、
内在小 体以及细胞膜下的管状池中, 在缺乏折叠或膜改变 的细胞膜区域仅观察到弱的标记。被膜囊泡、无被膜 囊泡和内在小体在配体结合后受体的内在化过程中 的作用已在多种细胞型中得到确定15 。 强 Y 1 受体 标记的管状池可能与内在体网相关, 代表着一个重 要的配体—— 受体解离位点15 。 因此有可能 Y 1 受 体首先内在化进入被膜囊泡, 在内在小体中加工处 理, 在内在小体网状池中与配体离解并被送回细胞 膜。 我们曾用同样技术分析了大鼠背根节中 Λ 阿片 受体的定位16 。Λ 阿片受体2L I 与 Y 1 受体2L I 相似, 呈斑点状分布在细胞膜附近, 然而, 在超微结构水平 金2银颗粒只沿着细胞膜光滑区域分布, 而与被膜囊 泡、内在小体或管状池无关16 。 Y 1 受体复杂的亚细 胞定位可能反应了一种高频的受体内在化的再循 环, 也许这种现象与正常背根节神经元中高水平的
3 讨 论
为了进一步探讨神经肽 Y 的 Y 1 受体在感觉传 导通路神经元中的分布特点和研究同种神经肽受体 亚型在不同神经元的分布特征, 本研究对背根节神 经元和脊髓¦ 层神经元进行了深入研究。
7
311 Y 1 受体 m RN A
是一致的; 这 Λ 阿片受体和 Y 1 受 体分布的不同也可能与它们的活化ƒ失活涉及不同
的细胞生物学过程有关。 这些结果证明在超微水平 对受体进行精确定位是了解受体活动状态的关键性 步骤。
如果 Y 1 受体在正常生理条件下被活化, 并不断 地进入内在化和再循环过程, 那么奇怪的是, 在正常 环境下只有用包埋后免疫标记方法才能在背根节神 经元检测到极低水平的 N P Y , 所以几乎排除了背根 节神经元上 Y 1 受体是自体受体的可能性。另两种可 能的 N P Y 来源是背根节中血管周围的自主神经纤
背根节神经元神经肽 Y 1 受体是胞体受体 在 以前的研究中7 我们报道了 Y 1 受体2L I 主要分布于 背
根节小神经元胞体膜附近, 只有极少量 Y 1 受体经 传入纤维运输到脊髓¦ 层内的终末。 同时也发现只 有极少量的 Y 1 受体经周围突起向周围运输, 因此, 背根节神经元的 Y 1 受体是一种胞体受体。以前的荧 光显微镜观察结果表明 Y 1 受体2L I 呈斑点有间隔 地沿细胞膜分布。
本研究通过对 Y 1 受体阳性背根节神经元由顶 部至底部系列共聚焦显微镜光学切片逐一分析, 并 在由细胞顶部至中心的许多叠加光学切片中对 Y 1 受体2L I 定位进行比较, 发现单个光学切片或是较 少的光学切片的叠加可以提供较准确的定位。Y 1 受 体2L I 在 细 胞 内 表 面 呈 标 记 强 度 不 一 的 斑 点 状 结
维7 和肾上腺释放到血流中的 N P Y 。背根节中血管 的通透性使血源性 N P Y 可以接触到背根节神经元 上的受体, 在这种状态下胞体膜上 Y 1 受体仍属于连
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