郧西三中
综合化学实验
实验目的要求
1．通过实验了解氨基酸羧基和胺基的保护方法和二肽的合成方法。
2．通过复习巩固TLC跟踪反应的实验方法，学习并掌握快速柱层析纯化有机化合物的实验技术。 3．通过1H NMR谱图对产物结构进行表征。
实验原理
氨基酸（amino acids）是生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系，是生命的物质基础。
肽键（peptide bond）是指一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合形成的酰胺键。肽（peptide）是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，是生物体内一类重要的活性物质。肽按其组成的氨基酸数目为2个、3个和4个等不同而分别称为二肽、三肽和四肽等，一般含10个以下氨基酸组成的称寡肽（oligopeptide），由10个以上氨基酸组成的称多肽（polypeptide）。
肽的合成是一项很繁杂的工作，肽中的肽键易发生多种反应，如水解、氨解等，这就要求合成肽的条件必须温和，因此要对参于反应的氨基、羧基进行“活化”，使反应容易进行；同时要将不参加反应的氨基和羧基暂时"保护"起来，只留下参加反应的氨基和羧基。肽的合成中所用的保护基既要容易接上，在反应时能起保护基团的作用，又要在肽键生成后容易除去，不致引起肽键的断裂。
常用保护氨基的方法是酰化，如叔丁基甲酰基（t-Boc）、对甲苯磺酰基、a-芴甲氧羰基（Fmoc）、苄氧羰基（CBz）等。羧基一般以盐或酯的形式加以保护，常用的酯有甲酯、乙酯、苄酯和叔丁酯等。甲酯和乙酯可用皂化法去保护，但易引起消旋；苄酯可用H2/Pd法或金属钠-液氨法去保护；叔丁酯可在温和条件下用酸除去保护。
本实验用苄醇与苯丙氨酸的羧基反应生成苄酯，以保护氨基酸的羧基。用
a-芴甲氧羰基（Fmoc ）酰化保护苯丙氨酸的氨基。本实验采用的EDCI 为缩合剂，在HOBT 和DMAP 作用下使苯丙氨酸中未保护的氨基和羧基进行缩合，生成二肽。EDCI 对水敏感，因此反应体系一定要保持干燥。
三相异步电动机论文实验步骤
1、苯丙氨基酸羧基的保护
+PhCH 2OH
Toluene C 9H 11NO 2
Mol. Wt.: 165.19
C 7H 8O
Mol. Wt.: 108.14
2
2Ph
TsO
C 23H 25NO 5S
Mol. Wt.: 427.51
于100 ml 圆底烧瓶中，加入2.0克 ( 0.012mol) L-苯丙氨酸、2.4克 (0.126mol)对甲苯磺酸一水合物、4ml 苄醇和30ml 甲苯，加热（约140℃）回流至反应完全，用油水分离器分离生成的水（油水分离器的支管需要用石棉条保温），记录生成水的体积。冷却，旋转蒸发浓缩至约5ml ，冷至室温后加入约50ml 乙醚，有白固体析出，抽滤，用少量乙醚淋洗，得粗产物。将粗产物用约3ml 甲醇全部溶解a （加热到约50℃），冷却到室温，加入30ml 乙醚，有白固体析出；如无固体析出，则放入冰箱中冷冻，约半小时有白固体析出。抽滤，得白固体，为L-苯丙氨酸苄酯对甲苯磺酸盐，干燥，称重，测熔点。取少量样品用甲醇溶解，进行TLC 分析，并与标准品对照。
附注：
a: 本步骤用于除去为反应的苄醇。苄醇的存在会影响到后面二肽的合成。
2、氨基酸氨基的保护
+
C
9H 11NO 2Mol. Wt.: 165.19
2
O
O
O N O
O
C 19H 15NO 5Mol. Wt.: 337.33
OH HN O
C 24H 21NO 4Mol. Wt.: 387.43
3
于100ml圆底烧瓶中加入0.7克碳酸氢钠，加入25ml水使之溶解，再加入1.0克（6 mmol）苯丙氨酸和1
0ml DMF，室温搅拌使苯丙氨酸全部溶解。冰水浴下，将1.8克（5.3 mmol）Fmoc-Osu和25ml DMF配成的溶液滴入反应瓶中，控制在5-10min内滴完，混合物于25-30℃下搅拌至反应完全（约2小时），每隔半小时取样点板分析，并与Fmoc-Osu对照b，停止反应（如果溶液不能澄清，则需补加10ml DMF）。将溶液转移至250ml烧杯中，用1N盐酸调节pH至2-3，有大量白沉淀析出，为Fmoc苯丙氨基酸。抽滤，用水洗2-3遍，固体置于60℃烘箱内烘干（约1小时），称重，测熔点。取少量产品用乙酸乙酯溶解，TLC分析并与标准品对照。
附注：
b：取样用乙酸乙酯溶解，展开剂为乙酸乙酯/甲醇=10/1
3、二肽的合成
OH
HN
O
C24H21NO4 Mol. Wt.: 387.43
通信与信息管理2
系统设计
Ph
TsO
C23H25NO5S
Mol. Wt.: 427.51
+
HN
O
O
2
Ph
C40H36N2O5
Mol. Wt.: 624.72
室温下，向干燥的100ml 圆底烧瓶中加入0.5克Fmoc苯丙氨基酸、0.55克L-苯丙氨酸苄酯对甲苯磺酸盐、0.26克Et3N（约0.4ml）和4mlDMF以及20ml CH2Cl2 ，搅拌均匀。最后迅速加入0.55克HATU，套上干燥管，搅拌，反应过夜，TLC检测反应完全。向反应混合物中补加20ml CH2Cl2，再加入20ml 1N盐酸，搅拌，分出有机层（下层）。有机层再依次用20ml饱和碳酸氢钠和20ml饱和食盐水洗涤。无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发浓缩至干，称重，记录粗产品的重量。
288uu附注：
c：过滤之后，用取样管取少量母液保留，用作点板对照。标准产物用四氢呋喃溶解，展开剂为二氯甲烷/四氢呋喃=1/1
粗产物用柱层析法纯化。过程如下：
装柱：于直径为1cm的层析柱中，加入300-400目硅胶至层析柱一半高，加入二氯甲烷，浸没硅胶，并使液面高出硅胶顶约1cm。
装样：向粗产物中加入约少量THF（约5ml）和100-200目硅胶（约2克），旋转蒸发至干，转移到培养皿中，置于红外灯下烘约5分钟，然后均匀装在硅胶柱的上端。
淋洗过柱：先50毫升二氯甲烷/四氢呋喃（20:1）混合液淋洗，再用50毫升二氯甲烷/四氢呋喃（10:1）混合液淋洗，最后50毫升二氯甲烷/四氢呋喃（1:1）混合液淋洗。分段收集在试管中，TLC跟踪。收集具有相同的较纯的产物点的溶液，浓缩，得到油状物，再加入20毫升乙醚，超声，过滤，烘干得到白固体，烘干称重计算产率；并测产物熔点。
思考题
1．查阅文献，列出在多肽合成中常用的氨基保护基，及其脱保护方法，并分析各保护基的优缺点。
2．分析二肽合成中缩合反应的原理，以及缩合剂所起的作用原理。
3．解析二肽产物的1H NMR谱图。
4．总结薄层层析与柱层析在操作过程中的注意事项。
骶骨
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