网络出版时间：202)-3-H16：33网络出版地址：https：//kks.cPh09/kcms/y9W/34.1045.R.2429317.152).42).htil
徐晶晶*，胡月*，刘文，宋雅娴，彭亚琴，何国平，吴丽敏，汪菁
摘要目的探索低深度全基因组测序技术联合核型分析在无创产前检测高风险孕妇产前诊断中的应用。方法对165例无创产前高风险孕妇行羊膜腔穿刺术，在对胎儿羊水样本进行G显带染体核型分析的同时采用低深度全基因组测序技术检测胎儿羊水细胞基因组DNA，测序结果与人类参考基因组(GRCh37,UCSC release hgH)进行比对分析，然后通过ISCA、Deciher、ClinV/r等数据库评估检测到的CNV致病性，进而比较G显带染体核型分析与低深度全基因组测序结果间的差异。结果送检的95例羊水样本中低深度全基因组测序检测出9)三体44例,H三体14例，9三体)例，与G显带染体核型分析结果一致；性染体异常2例，比G显带染体核型分析多检出)例；其他类型染体异常14例，比G显带染体核型分析多检出4例。低深度全基因组测序技术对染体异常的总检出率为53.33%，与染体G显带核型分析比较，致病性异常检出率提高了3%o结论低深度全基因组测序技术在无创产前检测高风险孕妇产前诊断中有良好的应用价值，该技术与G 显带染体核型分析联合应用能有效提高染体异常检出率，降低出生缺陷，
提高人口素质。
关键词无创产前检测高风险；低深度全基因组测序；核型分析；产前诊断
中图分类号R712.5
思维定势
文献标志码A文章编号1004-1492(242))44-469-45 0oi：14.19445/F c/dh issolOOO-992.242).04.029
无创产前检测技术(kon-invasive pre/atai tes-tig,NIPT)的推广应用有效提高了染体非整倍体异常的检出率，降低了人口出生缺陷率。但NIPT 的筛查也存在一定的局限性，既存在一定的漏筛风险，也存在一定比例NIPT结果与产前诊断染体核型分析结果不一致的情况，这其中一个重要原因
2027-11-12接收
基金项目：安徽省重点研究与开发计划项目(编号：202004j07020024);“科大新医学"联合基金(编号：
WK2119000051)
作者单位：中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)妇产科产前诊断中心，合肥430021
作者简介：徐晶晶，女，助理研究员；*对本文具有同等贡献
汪菁，女，主任医师，责任作者,E-mail:abwapu—1963@
126 是染体核型分析的分辨率为7~9Mb导致染体的微缺失微重复无法被检测到。而随着高通量测序技术的发展，低深度全基因组测序技术(/w-pass whole ge/ome sequedcip,Low-pas s WGS)被逐渐应用于产前诊断中，该项技术能检测到92Kb~5Mb 间的染体微变异，能有效弥补染体核型分析的不足。该研究对中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)105例NIPT高风险单胎孕妇的产前诊断染体核型分析结果和Low-pass WGS检测结果进行了回顾性研究分析，并评估了Low-pass WGS对提高无创高风险孕妇的产前诊断异常检出率的作用。
1材料与方法
1.1病例资料回顾性选择2212年1月一229年8月间因无创产前检测提示高风险来中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)进行侵入性产前诊断、并且同时进行染体核型分析和Low-pass WGS检测的95例单胎孕妇，年龄为22~35 (31.3±5.5)岁，孕周为9~28周。该研究通过该院伦理委员会批准，并且纳入研究的所有孕妇均签署知情同意书。
1.2研究方法
1.2.1羊膜腔穿刺术对孕妇的羊膜腔穿刺由具有产前诊断资质的医师在B超引导下进行，每个孕妇抽取3
管羊水，每管9ml，共30ml，其中2管羊水进行细胞培养，供染体核型分析，剩下1管羊水进行DNA提取，供Low-pass WGS检测。
1.2.2染体核型分析所有孕妇的羊水样本进行两线细胞培养，每线接种9ml羊水，培养至50左右进行换液,~20后在显微镜下观察，根据细胞生长状态确定细胞收获时间，而后利用枸椽酸钠低渗液消化法制片、吉姆萨染显带、最后进行核型分析。1.2.0Low-pass WGS检测每例孕妇羊水中取9 ml样本送至华大基因公司完成Low-pass WGS检测，其方法如下：使用DNeasp Blood&Tiss u e Kit (Qiagen)从羊水细胞中分离基因组DNA，使用52ng
基因组DNA作为起始模板，将DNA片段化至平均大小为152~220by，末端修复加A后用T4连接酶加上带有特殊标签序列的接头,PCR扩增两端带有接头的DNA片段，扩增后浓度检测，每个样本取等量的DNA进行混合，取混合后总量为92—的DNA进行单链分离和环化反应，最终得到单链环装DNA文库，在BGISEQD40测序仪上进行测序。测序结果使用Burrows-W heeler Aligner(Versiond.7.7)比对软件与人类参考基因组(GRCh35/kgl9)进行比对、分析，并通过UCSC、CknVar、OMIM、I SCA、Decl-pher、PuUmed等数据库检索，综合分析、评价所检测到的CNV致病性。
1.2.0随访电话随访所有纳入该研究的孕妇，对其妊娠结局及新生儿健康状况进行记录。
2结果
2.1无创产前检测高风险孕妇的染体异常类型分布情况165例孕妇中21三体高风险54例，占总例数的32.5%；9三体高风险19例，占总例数的&5%；H三体6例，占总例数的
3.6%；性染体异常(性染体数目偏多、偏少、片段缺失重复)64例，占总例数的38.8%；其他染体异常(除21、9、H、性染体外的染体数目异常及包括21、9、H 号染体在内的片段缺失重复)25例，占总例数的19.7%o
2.2无创产前检测高风险孕妇的染体核型结果分析21三体高风险孕妇中核型分析结果与NIPT 一致的有44例，其中包括1例罗氏易位型21三体和1例21三体合并2号染体倒位，阳性预测值为8228%;9三体高风险孕妇中核型分析结果与NIPT一致的有9例，阳性预测值为7243%；H三体高风险孕妇中核型分析结果与NIPT一致的有1例，为罗氏易位型H三体，阳性预测值为9.75%；性染体异常高风险孕妇中核型分析结果与NIPT 一致的有22例，包括：6例45,XXY；3例45,XYY；3例45,XXX；2例45,X；例46,X,i(X)(ql9)；5例性染体嵌合核型(45,X：10]/k2,XX[52]；45,XXY[6]/46,XY[62]；45,X：H]/k2,X,i (X)(qlO)[45]；45,X[48]/46,XY[22]；45,X [39]/46,X,i(X)(qlO)：8]),2例染体结构异常[46,XN,add(X)(p22.1)；46,XN,del(X) (p22.9]，阳性预测值为34.38%；其他染体异常高风险孕妇中检出6例与NIPT结果一致，包括：46, XN,-H,+mar；46,XN,de1(5)(/9)；46,XN,de1(1)(q42)；46,XN,0et(8)(p23)；42,XN,Uer (4)；45,XN,+22J//46,XN：62]；阳性预测值为22.22%o对97例无创产前检测高风险孕妇进行核型分析共检出83例异常核型，总异常检出率为52.6%o见表9
表1nipt高风险孕妇产前诊断核型分析结果
NOT高风险类型n-
产期诊断核型分析结果阳性
预测值(％)
异常(例)正常(例)
41三体高风险5/441231.46
H三体高风险1417471.48
H三体高风险61516.07
性染体异常64244434.33
其他类型染体异常4764124.24
合计105383450.36
2.3无创产前检测高风险孕妇的Low-pass WGS 结果分析对无创产前检测高风险孕妇进行产前诊断Low-pass WGS检测，21三体高风险孕妇中检出44例阳性，均为21三体；9三体高风险孕妇检出9例阳性，均为9三体;H三体高风险孕妇检出1例阳性，为H三体；性染体异常高风险孕妇检出23例阳性，3例45,XXX；6例45,XXY；3例45, XYY；2例47,X；5例嵌合体(包括2例47,X和42,XX嵌合体;1例45,XXY和42,XY嵌合体;1例X染体微重复嵌合体;1例Y染体微缺失嵌合体)4例X染体微缺失;1例9号染体微重复变异；其他类型染体异常高风险检出9例阳性,1例2号染体三体嵌合体;1例9号染体三体嵌合体;1例9号染体三体嵌合体;1例22号染体三体嵌合体;2例已知致病或可疑致病性常染体微缺失微重复变异。Low-pass WGS共检出致病性和可疑致病性变异例数88例，临床意义未明的变异(VOUS)56例，总异常检出率为5声波时差
3.3%。见表2o
产前诊断Luv-pap WGS结果致病变异表2NIPT高风险孕妇产前诊断Low-pass WGS结果
NOT高风险类型a
致病及
可疑致病
变异(例)
临床意义
未明变
异(例)
正常
(例)
检出率
(%)
41三体高风险54442131.46
H三体高风险14173171.48
13三体高风险614116.07
性染体异常6448231835.98
其他类型染体异常471714587.04
乾隆大阅图
合计1653574158.38
2.3无创产前检测高风险孕妇的染体核型结果 与Low-pass WGS 结果的比较 与核型分析相比,
Low-qass WGS 检出的21三体、18三体、0三体的
例数相同，但在性染体异常高风险孕妇中检出23 例异常，在核型分析基础上额外检出1例，该病例的 异常为12号染体微重复；另有1例性染体异常
高风险孕妇两种检测结果不太一致,Low-qass WGS
检测结果为46；X ，核型分析结果为46,X ：32］/d4,
X ,mX )(ql0) ［8］在其他染体异常高风险孕妇
中检出12例异常，在核型分析基础上额外检出4
例，分别为2号染体三体嵌合35号染体三体 嵌合、2号染体三体嵌合、2号染体微缺失。
Low-qass WGS 检出异常的总例数比核型分析多出6
例，总检出率提高3%o 见表3o 核型分析与Low-
pass WGS 结果不一致的病例。见表4o
表3核型分析与Low-pass WGS 异常检出率差异
NIPT 高风险类型一异常检出率(％)
核型分析
Low-pass WGS
21三体高风险31243312432三体高风险
71.45
71.45
15三体高风险15.0216.22性染体异常34.3335.95其他染体异常
22.22
57.24
总异常检出率52.3055.35
2.0随访结果 对纳入该研究的165例孕妇的妊
娠结局进行了电话随访。88例致病性染体异常 的孕妇中,82例孕妇已选择引产;6例孕妇在医生充 分告知后选择正常分娩，其中1例为42,XN , +21,
足月分娩，胎儿出生后已出现心脏异常;1例为42,
XXX ，足月剖宫产，胎儿出生后未见明显异常;1例
为42, XYY ，足月剖宫产，胎儿出生后未见明显异
常;1 例核型为 42,XXY(6)/46,XY(62、，Low-qass
WGS 结果为X 染体重复嵌合11%，足月分娩，胎
儿出生后未见明显异常；1例核型正常，Low-qass WGS 结果为19号染体三体嵌合体，嵌合比例为
12%，足月剖宫产，胎儿出生后未见明显异常;1例
核型正常，Low-qass WGS 结果为44, XN , dup
(17pl2、. seq ［ GRCh32/kgl2 ］ (10,092,791 - 19, 442934) x3，足月分娩，胎儿出生后未见明显异常。
3讨论
La / a0、］研究表明孕妇外周血血浆中存在胎
儿游离DNA,NIPT 技术迅速发展，已在全球范围内
成为一线染体非整倍体变异筛查项目。该研究中
21三体、2三体、及0三体的阳性预测值分别为
80 45% 3/. 43% 32. 62%，与以往报道［「5］基本一
致。NIPT 虽然对21三体38三体和10三体的检测
有较高准确性，但对其他染体异常及染体微缺
失、微重复灵敏度不高，并且其假阳性和假阴性问题
一直存在，主要原因包括限制性胎盘嵌合、双胎中一
胎凋亡、母体基因组拷贝数异常、母体恶性肿瘤、母
血中胎儿DNA 浓度低4］ o 因此在孕妇选择该项
检测时，临床医生应充分告知该技术的优势和局限
性，重视其他的孕期检查以防NIPT 的漏筛。
近年来,Low-qass WGS 在遗传学诊断和产前诊
断中的应用不断深入。《低深度全基因组测序技术 在产前诊断中的应用专家共识》［］的发表为Low- pass WGS 技术在产前诊断中的规范应用提供了指
导建议。Wang et al ［2］报道了 Low-qass WGS 前瞻性
临床研究数据，对3 429例羊水样本进行分析丄ow-
pass WGS 与核型分析相比，可额外检出1%的明确
致病性 CNV o Wang et ad 14］对 Low-pass WGS 与芯
片临床应用进行了比较分析，与芯片相比丄ow-pass
WGS 不仅对DNA 起始量要求更低，拥有更高的检
高龄,NIPT 提示性染体偏多
NIPT 提示X 染体短臂49Mb 缺失NIPT 提示12号染体数目偏多NIPT 提示15号染体数目偏多
高龄,NIPT 提示2号染体数目偏多
NIPT 提示2号染体存在局部缺失
表4核型分析与Low-pass WGS 结果不一致病例
年龄(岁)
临床指征核型分析结果
协查通报Low-pass WGS 结果
3525
513040
25
49, XN
45,X[39]/40,Xp(X) (ql2) [3]
49, XN 49 , XN 46 XN 46 XN
40,XN , dup(17pl2). (10,292,721 -15,442 , 934) x5
45X
羊水细胞DNA 中存在12号染体三体嵌 合，异常比例约为12%
羊水细胞DNA 中存在15号染体三体嵌 合，异常比例约为12%
羊水细胞DNA 中存在2号染体三体嵌合,
异常比例约为12%
46,XN, dei(7p21. Ip22. 1、.(6,965,125 - 17,575,192) xl
测分辨率，并且对致病、可疑致病性CNV检出率提高了05%，技术重复率从9.2%降低到了0.5%。该中心之前的报道40]提示对于高龄孕妇Low-pass WGS能在核型分析基础上有效提高异常检出率。该结果显示Low-pass WGS相较于核型分析总体异常检出率更高，其中两种方法的21三体高风险、1三体高风险、0三体高风险的异常检出率相同，但对性染体异常和其他染体异常的检出率分别提高了1.57%和14.82%。在该研究中Low-pass WGS 的优势主要体现在能检测出一些低比例嵌合体和染体微缺失、微重复的病例。对于21143三体高风险样本，在该研究中Low-pass WGS未能体现出其优势，可能原因在于一方面样本量较少(74例)，另一方面21三体、1三体、43三体高风险的样本总异常检出率较高(74.32%)o
综上所述,Low-pass WGS和核型分析联合应用于NIPT高风险人中能有效提高染体异常检出率，尤其是针对染体微缺失/微重复变异和低比例嵌合体的检测，但尚不能通过该研究说明是否需对NIPT高风险中21三体、1三体、0三体高风险孕妇采用Low-pass WGS，仍需更多的临床数据结果分析进行阐明。
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Combined applicetion of low-pass whole
genome sequencing and karyotyping in prenatal diagnosis of preynanS women with high risk in non-invasive prenatal testing
Xu Jin/ina,Hu Yue,Liu Wen,W ai
[Depi of Prenatai Diagnosis,Gynaecolofy tn ObstetrPe,TU t Firsi iffiliated
Hospitai of USTC^AC p I Provinciai Hospital),Hefd230021]
Abstrnct Objective Ta explore the aup/ca/ox of Hw depth whole genome se/pe/cina techniune combi
ned with kd：otyp3analysis in predata-d iagnosis of high Psh preynan-women.MethoOs Amniocentesis was pePonned in 17high-Tsh preynan-women.The G-Pankina kapotype of fetal amniotic fluid samples was analyzed while the ge-nomlc DNA of fetal amniotic Uuik dis was detected Uy Low-pas s whole genome wupeneda mchnoHyy.The w-puweda reads we:precisely manped usina the human gwome(GRCh37,UCSC release hgl7)as a reference. Then,the pUhoywiOo of CNVs was interrogate/in ISCA,Dwiphep ClinVar ank other datadases.The diOer-e/ces between G-Panked chromosome kapotype analysis ank Low-pass whole genome se/pe/cina results we:compared.Results Amoxa17amniotic fluid samples,44cases of t/somy21,17cases of t/somy1,1cases of tn-somy13we:detected Uy Low-pas s whole genome se/pe/cina.The result was copsiste/t with that of G-Pankda kapotype analysis:In addition,the:we:2cases of see chromosome aUkounality detected Uy Low-pass whole
铸铁工艺
网络出版时间：205)-3-1312：20网络出版地址：https：//kuskU uePkcms/demil/34.l/65.R.2/514812.155)■022.2tmi
MPO-ANCA相关性血管炎患者
中性粒细胞外捕网与滤泡辅助T细胞间关系的探讨
李廉、，潘梦璐、，郑美娟4帅宗文、
摘要目的探讨抗中性粒细胞胞质髓过氧化物酶抗体相关性血管炎(MPO-AAV)患者中性粒细胞外捕网(NET)与滤泡辅助T细胞(TO)间关系及意义。方法选择初诊未的MPO-AA V患者和健康对照者各35例，流式细胞术(FCM)检测所有受试者外周血TO占CD4+T细胞分数(TO%)、表达ILOS的TO占CD4+T细胞分数(ICOS+ TO%、及TO表达DOS的平均强度(MFI)；酶联免疫吸附试验(ELISA、法检测外周血MPO-ANCA、NET及IP-P3水平，收集每例受试者的临床资料，评估每例患者病情活动度(BVAS-A3)o结果与健康对照组比较，MPO-AAV组外周血TO%、ICOS+TO%、TO的MF)、NET及IP-P3水平均高于对照组[分别为(25.0±3.9)%ci(20.2±5.3)%,P< 4.04)；().9±).4)%e(4.8±0.4)%,P<4.00)；(59.5士14.3)v((48.2±6.0)(MF)),P<4.04)；(0.6±0.2)v( (0.2±4.1)(吸光度)，P<4.00)；(4.2535±4.20)9)vs (4.5375±4.0874)(p/d),P<4.00)]。双变量相关性分析提示MPO-ANCA水平分别与TO%及TO的MF)呈正相关(分别为『=4.782,P</.0/)；1=/.623,P<4.00))，但在 多变量线性回归分析显示MPO-ANCA仅与TO%相关(P< 4.04)/o IP-P3分别与TO%、TO的MF)及NET水平呈正相关(分别为：=4.075,P=4,352,P=4,034;=
2225-29-23接收
基金项目：安徽省重点研究与开发计划项目(编号：Z870hh8725223)
作者单位：安徽医科大学第一附属医院、风湿免疫科、、临床检验医学科流式细胞室，合肥030220
作者简介：李榛，女，主治医师；
帅宗文，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-
mail:amusnuaizq@125 4.846,P<4,04)/ o虽然双变量相关性分析提示TO%分别与外周血中NET及IP-P3水平呈正相关(分别为：=4.014, P<4.04);=4.080,P=0.004)，但多变量线性回归分析显示TO%仅与NET水平呈正相关(P<4.04)/：即NET是影响TO%的独立因素。同时，结果显示NET与肾损害间存在相关性5=4.394』=4.421)。结论NET可能通过激活髓样树突状细胞提升TO%，以辅助B细胞产生特异性自身抗体MPO1ANCA参与MPO1AAV发病。
关键词抗体；抗中性粒细胞胞质；抗过氧化物酶抗体；血管炎；滤泡辅助T细胞冲性粒细胞外捕网;IP-P3
中图分类号R523.02
文献标志码A文章编号1004-1492(202))04-4523-45 doi：14.12405/d cnkU iss/1400-1495.2/2、.04.453
kh560
抗中性粒细胞胞质抗体(antiueutuphC cytoplasmic antibody,ANCA)相关性血管炎(ANCA associate vvsculitis,AAV)临床常分为显微镜下多血管炎(mi-cuscopic polyangitis,MPA)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎(eosikophiCc yunummatous polyyngiitis,EGPA/和肉芽肿性多血管炎(yunulomatous polyangiitis, GPA)[i],MPA和EGPA中ANCA识别的主要自身抗原为髓过氧化物酶(myempeuxidase,MPO),GPA 中ANCA主要识别蛋白酶F(p/teasa3,PR3)，分别称为MPO-ANCA和PR3-ANCA[0]o在中国，AAV主要以MPO-ANCA阳性的MPA最为多见，中老年人高发，病程进展快，病死率高5]。MPO-AA V的确切发病机制未明，研究⑸表明，MPO-ANCA是致病自身抗体。B细胞发育成熟为分泌自身抗体
genome se/ue/cing,1cose more than that detected bp G-Panking ch/mosoma ka/otype analysis,ank12cusas of other types of chumosoma adkormality-4cusas more than that detected bp G-Panking ch/mosoma ka/otype analp-sis.Thu total detection rate of ch/mosomal abnormaliUes bp Low-pass whole genome se/ue/cing was53.33%, which was3%higher t han that bp ch/mosoma G-Panking ka/otype ukysis.Conclusion Low-pas s whole ga-noma se/ue/cing has a good agpUcation vvlua in prenatal diagnosis of preynaut women with high Ush in pon-invv-sNv pm/kP t—tiny.Thu combmed agpUcation of Low-pass whole genome sefue/cing ank G-Sanking ch/mosoma ka/otype analysis cun VOhP/y improve the detection rate of ch/mosoma aduomialitius in preanaut women with high Ush in uou-mvvsivv pm/kP testing,re/uce biNh defects ank improve pouulatiou qukCo.
Key words high UP in uou-mvvsivv pm/kP testing；mw-pass whole genome sefue/cing；ka/otyping；prepatal diagnosis
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