王文栋
裴泽浩
席小雪
崔伟亮张彤
常晓彤（河北北方学院医学检验学院，张家口075000）
中图分类号R392R34
文献标志码
A
文章编号
1000-484X （2021）09-1118-08
［摘
要］目的：挖掘microRNA -21（miR -21）在肺癌中的靶基因，探讨其与肺癌关联的分子机制；检测血清miR -21表达
水平，探讨其对肺癌诊断和病理分型的价值。方法：利用生物信息学方法挖掘miR -21靶基因，并进行染体定位、功能注释和互作分析。选取肺癌患者血清61例（含小细胞肺癌21例，腺癌18例，鳞癌22例）、正常对照血清26例。实时荧光定量PCR 技术检测miR -21表达水平，评估血清miR -21诊断不同病理类型肺癌效能。结果：获得miR -21肺癌靶基因30个，主要位于胞外，参与细胞凋亡、增殖等调控过程，能与ATP 和蛋白质结合；靶基因互作网络中PTEN 、PDCD4和CDKN1A 为中心节点蛋白。血清miR -21在肺癌患者中的相对表达水平显著高于正常对照组（P <0.001）；肺腺癌患者血清miR -21水平显著高于小细胞肺癌与肺鳞癌患者。血清miR -21诊断肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞癌、腺癌的AUC 分别为0.915、0.879、0.934、0.911、0.962。结论：miR -21的靶基因及其表达与肺癌相关，血清miR -21的检测能够辅助肺癌诊断，且有望用于腺癌的鉴别和病理分型。 ［关键词］肺癌；生物信息学；血清微小RNA21；诊断价值
Excavate target genes of miR -21in lung cancer patients and its expression diagnostic value in serum
WANG Wen -Dong ，PEI Ze -Hao ，XI Xiao -Xue ，CUI Wei -Liang ，ZHANG Tong ，CHANG Xiao -Tong.College of Lab Medicine ，Hebei North University ，Zhangjiakou 075000，China
［Abstract ］Objective ：To mine the target genes of microRNA -21（miR -21）in patients and investigate the molecular mecha⁃
nisms of its association with lung cancer ；to detect expression level of miR -21in serum and to explore its value in the diagnosis and
pathological classification of lung cancer.Methods ：Excavate target genes of miR -21by bioinformatics methods ，and the chromosome location ，functional annotation and interaction analysis of target genes were carried out.Serum of 61lung cancer patients （including 21cases of small cell lung cancer ，18cases of adenocarcinoma and 22cases of squamous cell carcinoma ）and 26normal controls were selected.Expression level of miR -21in serum was detected by real -time -fluorescence quantitative PCR to evaluate diagnosis efficacy of serum miR -21in different pathological types of lung cancer.Results ：Obtained 30target genes of miR -21with lung cancer ，these genes are mainly located outside the cell ，participate in the regulation process of apoptosis and proliferation and can combine with ATP
and protein ；PTEN ，PDCD4and CDKN1A are the central node proteins in the target genes interaction network.Relative expression level of serum miR -21in lung cancer patients were significantly higher than those in normal control group （P <0.001）；levels of serum miR -21in lung adenocarcinoma patients were significantly higher than that in small cell lung cancer and squamous cell lung cancer pa⁃tients.AUC of serum miR -21in lung cancer ，small cell lung cancer ，non -small cell lung cancer ，squamous cell carcinoma and adeno⁃carcinoma were 0.915，0.879，0.934，0.911and 0.962，respectively.Conclusion ：The target genes and expression of miR -21are re⁃lated to lung cancer ，the detection of serum miR -21can assist diagnosis of lung cancer and is expected to be used for the identification and pathological typing of adenocarcinoma.
［Key words ］Lung cancer ；Bioinformatics ；Serum microRNA -21；Diagnostic value
肺癌严重危害人类健康，其发病率、死亡率均居恶性肿瘤之首［1］。随着科学技术和精准医学的不断发展，肺癌手段有所提升。但由于大部分患者明确诊断时已发展至中晚期，手术效果甚微［2］。因此，寻非侵入性、高灵敏度、高特异性的肺癌肿瘤标志物的意义重大。
有研究表明，微小RNA （microRNAs ，miRNAs ）的表达与肺癌的发生、发展密切相关，在肺癌肿瘤
doi ：10.3969/j.issn.1000-484X.2021.09.017
①本文为河北省高等学校科学技术研究项目（Z2018032）；河北省卫
生计生委医学科学研究课题计划项目（20180811）；河北省高等学校科学技术研究重点项目（No.ZD2018076）；国家级大学生创新创业训练计划项目（No.201910092006）；河北北方学院自然科学项目（YB2020012）。
作者简介：王文栋，女，硕士，讲师，主要从事生物信息学、代谢与生
物钟紊乱方面研究，E -mail:****************。
通信作者及指导教师：常晓彤，女，硕士，教授，主要从事脂代谢障碍
相关疾病的分子机制与临床应用，E -mail:******************** 。
细胞的黏附、浸润和扩散过程中发挥重要调节作用［3］。由于miRNAs在肿瘤组织和外周血液中表达相对稳定，组织特异性较高，使其在肺癌诊断和分型中的应用成为可能，具有探索价值［4］。既往研究发现，miR-21不仅在肺癌患者的肿瘤细胞中表达升高，其在外周血中表达水平也高于正常人，与肺癌的发生、发展、转移和预后不良有关［5］。鉴于此，
miR-21可能是一种有前途的肺癌诊断和预后监测的无创标记物，但外周miR-21表达水平是否与肺癌病理分型有关目前尚无报道，且miR-21作用的分子机制尚不明确。因此，本研究拟通过生物信息学分析方法挖掘miR-21靶基因及其分子特征，然后采用实时荧光定量PCR技术（real-time fluorescence quan⁃titative PCR，RT-qPCR）检测不同病理类型肺癌患者（小细胞肺癌、鳞状上皮细胞肺癌、腺癌）与健康对照人血清的miR-21表达水平，进行ROC（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线分析，以丰富miR-21与肺癌关联的分子机制、探讨血清miR-21对于肺癌诊断及病理分型的价值。
1资料与方法
1.1资料收集中国人民解放军第二五一医院经病理检查确诊的肺癌患者静脉血标本61例（含小细胞肺癌21例，腺癌18例，鳞癌22例）及该院同期正常体检人静脉血标本26例。人miR-21引物套装购自苏州吉玛基因股份有限公司；内参U6引物购自美国Invitrogen公司；Trizol、FastQuant RT Kit、SuperRe⁃al PreMix Plus购自北京天根生化科技有限公司。
1.2方法
1.2.1肺癌miR-21靶基因的生物信息学挖掘与分析1.2.1.1肺癌miR-21靶基因挖掘利用miRe⁃cords数据库（http：//c1.accurascience/miRe⁃cords/）［6］对人的miR-21进行靶基因预测。并用Pic⁃Tar
、PITA、MirTarget2、RNAhybrid和TargertScanS等11个miRNA靶基因预测工具对miRecords预测结果进行验证，保证至少被2种不同算法预测的交集作为miR-21的靶基因。再使用GeneCards数据库（https：///）［7］搜索获得肺癌的相关致病基因，将致病基因与miRecords得到的靶基因取交集得到肺癌miR-21靶基因集合。
1.2.1.2肺癌miR-21及其靶基因染体定位利用UCSC数据库（http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/ hgGateway）［8］和MapGene2Chrom web v2在线分析工具（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0）［9］对肺癌miR-21及靶基因进行染体定位和可视化分析。
1.2.1.3肺癌miR-21靶基因的功能注释和STRING互作分析利用DAVID数据库（Visualiza⁃tion，Annotation and Integrated Analysis，https：//da⁃v）［10］采用全新的模糊聚类算法，将肺癌miR-21靶基因关联到生物学功能注释上，出最
显著富集的生物学功能注释（P-value≤0.05和Count≥4genes），有利于对肺癌进行关联性研究分析。联合使用STRING11.0在线分析工具（https：///）［11］和Cytoscape3.6.1软件［12］构建肺癌miR-21靶基因编码产物蛋白的互作网络，筛选出重要的中心节点蛋白。
1.2.2肺癌血清miR-21表达水平检测和诊断肺癌效能评估
1.2.2.1RT-qPCR Trizol法提取样本血清总RNA。TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit 进行逆转录反应。逆转录反应总体系为10µl，分别加入10×Fast RT Buffer2µl、U6Reverse Primer2µl、RNase-Free ddH2O3µl、microRNA-21Stem Loop Primer2µl和RT Enzyme1µl（即用即溶）。RT-qP⁃CR每个样本做3个复孔，miRNA反应体系为20µl：2×Super Real Premix Plus10µl（终浓度为1×）、miR-21PCR Primer Set（包含上下游引物）0.8µl、RNase-Free ddH2O8.2µl和cDNA模板1µl。内参基因U6的反应体系为20µl：2×Super Real Premix Plus10µl （终浓度为1×）、U6Forward Primer0.6µl、U6Re⁃verse Primer0.6µl、RNase-Free ddH2O7.8µl和cD⁃NA模板1µl。设置PCR反应模式，进行PCR扩增（反应模式：95℃，3min；95℃，12s；62℃，40s；共40个循环）。记录各管Ct值，复孔间Ct值之差>0.5，需重复实验。
1.2.2.2数据处理以U6为内参基因，加入待测血清，实现目标基因均一化处理。待测血清miR-21的相对表达量公式：RQ=2-∆∆Ct。RQ<1，则肺癌患者血清中目的基因表达水平高于正常人目的基因表达水平；反之，则肺癌患者血清中目的基因表达水平低于正常人目的基因表达水平。∆Ct=Ct Target-Ct Reference（Ct Target代表待测样本目标基因Ct值均值；Ct Reference代表待测样本内参基因Ct值均值）。肺癌患者与正常人血清目的基因表达水平变化比较公
式：RQ=2-∆∆Ct；∆∆Ct=（Ct Target-Ct Reference）
肺癌组
radarsat-（Ct Target-Ct Reference）正常组。
1.3统计学分析对miR-21的相对表达水平（2-∆∆Ct）进行对数转换，转换后数据符合正态分布。数据以xˉ±s表示，采用SPSS19.0软件分析。统计
方法为独立样本t检验，多组数据比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1肺癌miR-21靶基因使用miRecords数据库得到至少被2种不同算法预测且经过实验验证的
miR-21靶基因共计30个。利用GeneCards数据库获取肺癌相关致病基因共计22367个，将此22397个致病基因与上述30个miR-21靶基因做交集，发现30个miR-21靶基因均存在于肺癌发病相关基因集合中，由此筛选到肺癌miR-21靶基因共计30个，分别为：肿瘤抑制因子原肌球蛋白1（TPM1）、核因子IB（NFIB）、细胞程序性凋亡蛋白4（PDCD4）、ser⁃pin家族B成员5（SERPINB5）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（CDKN1A）、细胞表面凋亡受体（FAS）、代谢调节信号分子C（FAM3C）、同源结构域相互作用蛋白激酶3（HIPK3）、跨膜γ羧基酸蛋白4（PRRG4）、肌动蛋白α2（ACTA2）、抗增殖因子2（BTG2）、2型骨形态发生蛋白受体（BMPR2）、雌激素家族1（SESN1）、白介素受体6（IL6R）、细胞因子信号传导抑制因子5（SOCS5）、糖皮质激素1（GLC
⁃CI1）、凋亡肽酶激活因子1（APAF1）、溶质载体家族16成员10（SLC16A10）、血清/糖皮质激素调节激酶家族成员3（SGK3）、半胱氨酸胞外蛋白质2（RP2）、细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）、肌动蛋白结合蛋白2（CFL2）、富含半胱氨酸的胞外蛋白质（RECK）、金属肽酶抑制剂3（TIMP3）、甲硫腺苷磷酸化酶（MTAP）、SRY-box转录因子5（SOX5）、磷酸酶张力蛋白同源物（PTEN）、转移因子1（E2F1）、转化生长因子β受体2（TGFBR2）和细胞分裂周期25A （CDC25A），见图1。提示miR-21在肺癌的发生、发展过程中可能起重要作用。
2.2染体定位利用UCSC数据库和Map⁃Gene2Chrom web v2在线分析工具对肺癌miR-21及其靶基因进行染体定位和可视化分析，miR-21位于人类17q2
3.1染体，具体位置为chr17：59，841，266-59，841，337，长度22bp。肺癌miR-21靶基因在染体分布如图2。
2.3靶基因功能注释和互作网络利用DAVID数据库将肺癌miR-21靶基因关联到生物学功能注释上，最显著富集的生物学功能注释（P-value≤0.05和Count≥4genes）见图3，包括：regulation of cell prolif⁃eration（细胞增殖调节，含SGK3，TGFBR2，BM⁃PR2，FAS4个基因）、protein phosphorylation（蛋白质磷酸化，含GK3，HIPK3，TGFBR2，CDK64个基因）、protein kinase binding（蛋白激酶结合，含E2F1，AC⁃TA2，PTEN，CDC25A4个基因）、protein binding（蛋白质
绑定功能，含RECK，E2F1，SGK3，FAM3C，RP2，TGFBR2，BMPR2，SOX5，CDK6，IL6R，SOCS5，TPM1，SESN1，PDCD4，TIMP3，PTEN，CDC25A，CD⁃KN1A，BTG2，SERPINB5，CFL2，MTAP，FAS，
APAF1
图1肺癌miR-21靶基因
Fig.1miR-21target genes in lung
cancer
图2肺癌miR-21及其靶基因染体定位
Fig.2Chromosomal localization of miR-21and its target
genes in lung
cancer
图3肺癌miR-21靶基因功能注释图
Fig.3Functional annotation map of miR-21target genes
in lung cancer
共计24个基因）、negative regulation of cell prolifera⁃tion （细胞增殖负调控，含CDKN1A ，BTG2，CDK6，PTEN 4个基因）、negative regulation of apoptotic pro⁃cess （细胞凋亡负调控，含CDKN1A ，HIPK3，FAS ，PTEN ，PDCD45个基因）、extracellular exosome （胞
外，含BTG2，ACTA2，SERPINB5，FAM3C ，CFL2，RP2，MTAP ，APAF1，FAS ，TIMP3共计10个基因）、cytosol （细胞液，含SGK3，ACTA2，TGFBR2，CDK6，TPM1，PDCD4，PTEN ，SESN1，CDC25A ，CDKN1A ，BTG2，MTAP ，APAF1，FAS 共计14个基因）、cyto⁃plasm （细胞质，含ACTA2，SERPINB5，HIPK3，RP2，BMPR2，MTAP ，CDK6，FAS ，GLCCI1，SOCS5，SESN1，PTEN ，PDCD4，CDC25A 共计14个基因）、ATP binding （ATP 结合，含SGK3，ACTA2，HIPK3，TGFBR2，BMPR2，CDK6，APAF17个基因）、apoptot⁃ic process （细胞凋亡过程，含HIPK3，TGFBR2，APAF1，FAS ，PTEN ，PDCD46个基因），miRNA -21靶基因
主要分布在细胞外，参与细胞凋亡、细胞增殖的调控过程、具有与ATP 和蛋白质结合的功能，miRNA -21靶基因的异常表达可能与癌症的发生密切相关。
利用STRING11.0在线分析工具和Cytoscape
3.6.1软件构建了肺癌miR -21靶基因编码产物蛋白
的互作网络，发现有24个靶基因，分别为PTEN ，PDCD4，CDKN1A ，TIMP3，SERPINB5，CDK6，RECK ，TPM1，BTG2，CDC25A ，E2F1，APAF1，ACTA2，TGF⁃BR2，FAS ，SESN1，HIPK3，SGK3，PRRG4，GLCCI1，
NFIB ，FAM3C ，CFL2和MTAP 之间存在蛋白互作关系，其中PTEN 、PDCD4和CDKN1A 为关键的、重要的中心节点蛋白（图4）。2.4
血清miR -21的表达与诊断价值评估
提取的
总RNA OD 260/OD 280为1.8~2.1可用于进一步检测。miR -21及U6内参均能实现特异性扩增，溶解曲线为单峰，具有特异性，实验结果可靠。血清miR -21在肺癌患者血清中的表达水平远高于正常人
（图5A ），差异有统计学意义（P <0.001）；各型肺癌相比（图5B ），腺癌患者血清miR -21的表达水平显著高
于小细胞肺癌与鳞癌患者（P <0.05），而后两者之间无差异（P >0.05）。根据各型肺癌患者血清miR -21扩增数据，绘制受试者ROC 曲线，直观反映其诊断
图5血清miRNA -21表达水平和ROC 曲线
Fig.5
Expression level and ROC curves of miRNA -21in serum
科技情报开发与经济Note ：A~B.Expression levels of miRNA -21in serum ；C~G.ROC curves of miRNA -21in serum.SCLC.Small cell lung cancer ；NSCLC.Non -small
cell lung cancer ；LUSC.Lung squamous cell carcinoma ；LUAD.Lung
adenocarcinoma.
图4肺癌miR -21靶基因互作网络图
Fig.4
Interaction network of miR -21target genes in lung cancer
价值。血清miR-21诊断肺癌（图5C）、小细胞肺癌（图5D）、非小细胞肺癌（图5E）、鳞状上皮细胞肺癌（图5F）、腺癌（图5G）的AUC分别为0.915、0.879、
0.934、0.911、0.962，见表1。使用Medcalc软件，根据ROC曲线，获得血清miR-21诊断肺癌及不同病理类型肺癌的临界值、灵敏度和特异性（表2）。
3讨论
恶性肿瘤的诊断是现代医疗和精准医学的研究热点，引起广泛关注。实现无创早期准确诊断，能够明显延长患者生存期，并降低其死亡率。mi-RNAs通过与靶mRNA的3'端非翻译区结合，诱导靶mRNA降解或抑制其翻译，从转录后水平调控基因表达。自发现miR-Lin4至今，人类基因组中发现的miRNAs基因已达2500个以上，在细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程的调节中发挥重要作用［13］。
人类miR-21位于人类染体17q23.1，其靶基因主要分布在1、2、3、6、7、8、9、10、11、12、14、15、17、18、20、22和X染体上，而在5、13、16、19、21和Y染体上没有肺癌关联的miR-21靶基因。有研究表明miR-21的异常表达与实体肿瘤密切相关，可能通过下调肿瘤抑制因子原肌球蛋白1（TPM1）、骨形态发生蛋白（BMP）通路相关基因、TCF21-KISS1基因、p53基因、细胞程序性凋亡蛋白4（PDCD4）促进肿瘤细胞增殖，抵抗细胞分化凋亡，发挥癌基因功能［14-19］。本研究获得的miR-21靶基因中，APAF1、
FAS、GLCCI1、IL6R、NFIB和SOX5与细胞凋亡、分化过程有关，miR-21可能通过调控这些基因抵抗细胞凋亡分化，引发癌变；BTG2、CDC25A、CDK6、CD⁃KN1A、E2F1、SGK3、TGFBR2和TIMP3作为细胞周期的监测点，控制细胞周期的正常过度，miR-21可通过调控这些基因促进细胞增殖；ACTA2、BMPR2、CFL2和TPM1参与肌丝肌球蛋白的合成，miR-21可通过调控这些基因进行微丝微管生成的调节，进而影响细胞分裂过程；FAM3C被鉴定为上皮-间质转化和转移进展的新型调节剂，可用于区分临床早期患者的预后［20］。有研究表明miR-21参与非小细胞肺癌上皮-间充质转化状态的自分泌和旁分泌回路［21］；HIPK3在癌症组织和细胞系中表达不同，在癌症细胞生长，转移和血管生成中起双重作用，可能是癌症的潜在靶标［22］；MTAP具有肿瘤抑制活性，该基因编码一种在多胺代谢中起主要作用的酶，其在许多癌症中均缺乏［23］；PTEN是一种抑癌基因，通过负调节AKT/PKB信号传导途径起抑癌作用［24］，而miR-21可通过此途径诱导上皮-间充质转化起关
键作用［25］；RECK基因编码的蛋白质是富含半胱氨酸的胞外蛋白质，其表达在许多肿瘤和各种癌基因转化的细胞中均被强烈抑制，RECK的过表
表1各型肺癌患者血清miR-21的诊断效能
Tab.1Diagnostic efficacy of serum miR-21in patients with various types of lung cancer
Groups
Lung cancer Small cell lung cancer Non-small cell lung cancer Lung squamous cell carcinoma Lung adenocarcinoma AUC
0.915
0.879
0.934
0.911
0.962
Standard error
0.033
0.048
0.029
0.040
0.024
P
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
Progressive95%confidence interval
lower limit
0.851
0.785
0.876
0.832
0.914
upper limit
0.979
0.974
0.991
0.989
1.000
表2血清miR-21对于肺癌诊断及其病理分型的价值
Tab.2Value of serum miR-21for diagnosis and pathological type of lung cancer
Groups
Lung cancer Small cell lung cancer Non-small cell lung cancer Lung squamous cell carcinoma Lung adenocarcinoma Diagnostic
threshold
关于依法严惩危害食品安全犯罪活动的通知5.70
6.03
4.86
6.05
4.86
Sensitivity
（%）
76.92
海蛇头69.23
92.31
69.23
92.31
Specificity贸易收支
（%）
91.80
95.24
80.00
100.00中国特新型城镇化道路
88.89
Ppv
（%）
90.32
70.37
93.94
73.33
88.24
Npv
（%）
80.00
90.00
72.73
100.00
88.89
Note：Ppv.Positive predictive value；Npv.Negative predictive value.
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