Vol.41No.5May 2021
上海交通大学学报（医学版）
JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE)
李玲玲1，2
，李
倩2，李明玉2，刘峥3，沈倩诚2
1.上海市儿童医院，上海交通大学附属儿童医院中心实验室，上海200062；
2.上海交通大学基础医学院医药生物信息学中心，上海200025；
3.上海工程技术大学管理学院，上海201620
［摘要］目的·分析成人与儿童急性髓系白血病（acute myeloid leukemia ，AML ）患者骨髓中肿瘤免疫相关的差异表达基因
（differentially expressed genes ，DEGs ）。方法·从GEO （Gene Expression Omnibus ）数据库下载GSE134589数据集，选取初次确诊/复发状态的患者，按年龄分为儿童组（0~16岁，34例）、中青年组（17~59岁，62例）和老年组（60~80岁，62例），用R 语言程序包筛选不同组患者骨髓样本中肿瘤免疫相关的DEGs 。选取中青年组与儿童组，老年组与儿童组共同的DEGs ，与完全缓解状态的成人与儿童患者的DEGs 进行比对，并进行功能富集分析。利用Kaplan-Meier 法筛选与预后显著相关的基因，通过构建蛋白质相互作用（protein-protein interaction ，PPI ）网络筛选核心调控基因，将以上2种方法筛选出的基因视为关键基因。用GEPIA 服务器对比关键基因在AML 、弥漫大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma ，DLBCL ）和胸腺癌的肿瘤样本与正常人样本的表达量，在GEXC 网站分析关键基因在AML 患者肿瘤干细胞和健康人的原始造血细胞中mRNA 的表达情况。结果·GSE134589数据集中，中青年组与儿童组比，上调的DEGs 有51个，下调的有21个；老年组与儿童组比，上调的DEGs 有47个，下调的有20个；而中青年组与老年组比，没有发现DEG 。筛选了中青年组和老年组共同的肿瘤免疫相关DEGs 57个，其中上调有39个，下调有18个，仅有3个基因的表达水平差异在疾病完全缓解时仍有统计学意义。57个共同DEGs 主要富集在白细胞迁移和细胞因子介导的信号通路，其中白细胞介素2受体α亚基（interleukin-2receptor subunit alpha ，IL2RA ）、FMS-样酪氨酸激酶3（FMS-like tyrosine kinase 3，FLT3）高表达的患者与低表达的患者相比总体生存期显著缩短（均P <0.05），补体成分3a 受体1（complement component 3a receptor 1，C3AR1）是PPI 网络的核心调控基因。这3个基因作为关键基因，均在AML 肿瘤样本特异性高表达（均P <0.05），IL2R
A 还在DLBCL 患者样本中显著高表达（P <0.05）。IL2RA 在AML 肿瘤干细胞和健康人的原始造血细胞中均低表达，FLT3均高表达，而C3AR1的表达在AML 肿瘤干细胞特异性升高。结论·成人与儿童AML 患者预后的差异可能与骨髓中肿瘤免疫相关基因表达的差异有关，其中IL2RA 、FLT3和C3AR1可能是发挥重要作用的关键基因。
［关键词］急性髓系白血病；肿瘤免疫；差异表达基因；白细胞介素2受体α亚基；FMS-样酪氨酸激酶3；补体成分3a 受体1［DOI ］10.3969/j.issn.1674-8115.2021.05.004
［中图分类号］R733.71
［文献标志码］A
Analysis of tumor immune -related differentially expressed genes in adults and children with acute myeloid leukemia
LI Ling -ling 1,2,LI Qian 2,LI Ming -yu 2,LIU Zheng 3,SHEN Qian -cheng 2
1.Department of Central Laboratory,Shanghai Children's Hospital,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200062,China;
2.Medicinal Bioinformatics Center,Shanghai Jiao Tong University College of Basic Medical Sciences,Shanghai 200025,China;
南楚
3.School of Management,Shanghai University of Engineering Science,Shanghai 201620,China
[Abstract ]Objective ·To analyze tumor immune-related differentially expressed genes (DEGs)in the bone marrow of adults and children with acute
myeloid leukemia (AML).Methods ·The GSE134589data set was downloaded from the GEO (Gene Expression Omnibus)database,and the patients in initial diagnosis/relapse were selected and divided into children group (0‒16years old,34cases),young and middle-aged group (17‒59years old,62cases)and elders group (60‒80years old,62cases).The tumor immune-related DEGs in the bone marrow samples of different groups of patients were screened by R language packages.The common DEGs of young and middle-aged group vs children group and elders group vs children group were compared with the DEGs of adults group vs children group in complete remission,and the functional enrichment analysis was conducted with the common DEGs.The Kaplan-Meier method was used to screen the DEGs that were significantly related to prognosis,and the core regulatory DEGs were screened by constructing a protein-protein interaction (PPI)network.The gene
s screened by the above two methods were regarded as key genes.The expression levels of the key genes in AML,diffuse large B cell lymphoma (DLBCL)and thymoma tumor samples and normal human samples were compared by GEPIA server,and the mRNA expression levels of key genes in the human AML tumor stem cells and the original hematopoietic cells of healthy people were analyzed by GEXC website.Results ·In the GSE134589data set,there were 51DEGs up-regulated and 21down-regulated between
[基金项目]上海市卫生和计划生育委员会青年项目（20184Y0220）。
[作者简介]李玲玲（1988—），女，实验技术员，硕士生；：******************** 。[通信作者]沈倩诚，：**************** 。
[Funding Information ]Youth Project of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (20184Y0220).[Corresponding Author ]SHEN Qian-cheng,E-mail:****************.
论著·基础研究
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2021,41（5）上海交通大学学报（医学版）
the young and middle-aged group and the children group;47DEGs were up-regulated and20down-regulated between the elders group and the children group;no DEG was found between the young and middle-aged group and the elders group.Fifty-seven tumor immune-related DEGs were screened in both the young and middle-aged group and the elders group,of which39were up-regulated and18were down-regulated;in these DEGs only3genes showed statistically significant difference in expression level when the disease was incomplete remission.The57common DEGs were mainly enriched in leukocyte migration and cytokine-related signal pathways.The patients with high expression of interleukin-2receptor subunit alpha(IL2RA)and FMS-like tyrosine kinase3(FLT3)had significantly shorter overall survival than those with low expression(both P<0.05),and complement component3a receptor1(C3AR1)was the core regulatory gene of the PPI network.The three DEGs were selected as key genes.They were all specifically highly expressed in the AML tumor samples(all P<0.05),and IL2RA was also significantly highly expressed in the DLBCL samples(P<0.05).The expression level of IL2RA was low both in the AML tumor stem cells and the original group of hematopoietic cells,but FLT3was highly expressed in these cells.The expression level of C3AR1was specifically high in the AML tumor stem cells.Conclusion·The difference in the prognosis between adults and children with AML may be related to the differences in the expression of tumor immune-related genes in bone marrow,in which IL2RA,FLT3and C3AR1may be the key genes.
[Key words]acute myeloid leukemia(AML);tumor immunity;differentially expressed gene(DEG);interleukin-2receptor subunit alpha(IL2RA);FMS-like tyrosine kinase3(FLT3);complement component3a receptor1(C3AR1)
急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一类发病机制具有高度异质性的造血干细胞异常的克隆性疾病，由于患者骨髓中不同分化阶段的髓系细胞分化阻滞与异常增殖，常出现造血功能衰竭、髓外器官浸润、代谢功能异常等临床表现［1］。AML可发生于任何年龄，在儿童急性白血病中的占比约为30%，在成人急性白血病中的占比约为80%。患有AML的儿童长期生存率为40%~60%，60岁以下的中青年患者长期生存率为35%~ 40%，60岁以上的老年患者则为5%~15%［2］。AML的预后不良多与复发和相关的并发症有关。尽管AML的细胞分型和基因分型是预测患者生存率的重要指标，但年龄仍然是重要的预后独立预测因素之一，除了可能与老年人的身体条件较差有关以外，还可能与不同年龄阶段的骨髓免疫基因表达差异有关。AML表现为造血干细胞的分化异常，这与免疫基因的表达密不可分。肿瘤免疫相关基因的表达是免疫细胞、肿瘤干细胞、基质细胞与细胞因子之间相互作用的结果，它们共同进化，最终形成了对肿瘤有支持作用的肿瘤微环境，从而促进了白血病的发生、发展［3］。
为了探讨AML患者骨髓中肿瘤免疫相关基因的表达是否影响患者的长期生存率，本研究对GSE134589数据集中不同年龄段的AML患者骨髓中的肿瘤免疫相关基因进行生物信息学分析。根据不同年龄段的
生存率差异［2］，将AML患者分为儿童组、中青年组和老年组，筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），探究骨髓中肿瘤免疫相关的DEGs与成人AML预后较差的相关性，并寻对AML发展有关键影响的免疫基因。
1资料与方法
1.1数据筛选
在GEO（Gene Expression Omnibus）［4］数据库（
肖秉林
1.2DEGs筛选
根据长期生存率的差异［2］，将数据分为儿童组（0~ 16岁）、中青年组（17~59岁）、老年组（60~
80岁），选取初次确诊与复发的样本，其中儿童组34例，中青年组62例，老年组62例。基因表达的差异用FDR（false discovery rate）校正后的P值（q-value）和差异倍数（fold change，FC）的对数（log
2
FC）表示。本研究以q-
value<0.01且|log
2
FC|>2为筛选条件，使用R语言（版本4.0.2）limma、pheatmap、ggplot2等程序包［7］分析中青年组与儿童组、老年组与儿童组、中青年组与老年组的DEGs。选择取样时患者状态为完全缓解的样本，以同样的条件筛选儿童组（5例）和成人组（17~80岁，23例）的DEGs，并与初次确诊/复发样本的DEGs进行比较。1.3富集分析
取中青年与儿童AML患者的DEGs和老年与儿童AML患者的DEGs的交集，绘制韦恩图，取共同上调或下调的DEGs，使用［8］映射到GO（Gene Ontology）、Reactome和KEGG（Kytoto Encyclopedia of Genes and Genomes）的生物过程和信号通路，将P<0.05作为其具有统计学意义的
指标。
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李玲玲，等成人与儿童急性髓系白血病患者肿瘤免疫相关的差异表达基因分析
1.4DEGs的mRNA表达及其与总体生存期的相关性
在线检测系统分析
GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）是一个交互式网站服务器［9］，包含TCGA和GTEx项目的33种癌症和正常样品的RNA测序表达数据。根据TPM（transcripts per million）归一化方法，将AML患者分为DEG高表达组（53例）和DEG低表达组（53例），采用Kaplan-Meier法分析以上2组组织中DEGs对AML总体生存期的影响，筛选与预后显著相关的基因，将其作为关键基因。
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1.5构建DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用网络
使用在线数据库STRING（/）分析蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）［10］，构建DEGs的PPI网络；采用Cytoscape3.8.0软件进行可视化［11］，并
使用Cytoscape的CytoHubba插件［12］的EPC（edge percolated component）拓扑分析方法筛选连接度高的为有主要作用的蛋白分子。分别用Cytoscape的MCODE［13］与在线工具对PPI 网络进行密集度分析，进一步筛选PPI网络最显著模块的中心节点基因，也将其作为关键基因。
1.6关键基因验证
利用GEPIA网站对关键基因在173例AML患者白细胞样本与70例正常人白细胞样本的表达数据进行验证；同时横向对比关键基因在47例弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）肿瘤组织与337例正常人全血样本、118例胸腺癌（thymoma，THYM）肿瘤组织与337例正常人全血样本以及2例正常胸腺组织样本的表达数据，预测关键基因在肿瘤发展过程中的功能。从Gene Expression Commons（gexc.riken.jp/ models/7/genes）下载数据［14］，分析关键基因在AML患者肿瘤干细胞和健康造血细胞中mRNA的表达情况，筛选具有肿瘤干细胞特异性的基因。
2结果
scl-902.1不同年龄段AML患者肿瘤免疫相关的DEGs聚类
分析
本研究用R语言分析来源于数据集GSE134589的DEGs。将初次确诊与复发的样本分为儿童组34例、
中青年组62例、老年组62例。从热图中，可以看出中青年组与儿童组（图1A）、老年组与儿童组（图1B）免疫相关北美论坛 小说
基因的差异区分明显，组内基因表达情况具有高度一致性。
2.2不同年龄段AML患者肿瘤免疫相关DEGs的筛选
将参数符合q-value<0.01且|log
2
FC|>2的基因视为DEGs，使用R语言绘制AML患者骨髓中肿瘤免疫相关基因的火山图。中青年组与儿童组比，结果显示上调的DEGs有51个，下调的有21个（图2A）；老年组与儿童组比，上调的DEGs有47个，下调的有20个（图2B）；而中青年组与老年组比，没有发现DEG（图2C），提示儿童与成人（包括老年人）AML患者骨髓中肿瘤免疫相关基因的表达具有显著差异，而成年后患者间的差异不明显。
2.3DEGs的韦恩图和富集分析
从DEGs的韦恩图可知，相比儿童组，中青年组和老年组共同上调的基因有39个（图3A）；共同下调
的基因有18个（图3C）。为了探索DEGs相关的信号通路，用网站对39个共同上调的基因和18个共同下调的基因进行富集分析，结果显示共同上调的DEGs主要富集在白细胞迁移、细胞因子介导的信号通路、细胞因子产生的调节、细胞-细胞黏附的调节、造血细胞谱系、髓系白细胞激活、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路和白介素介导的信号转导等（图3B）；共同下调的DEGs主要富集在细胞对脂多糖的响应、白细胞增殖、炎症反应的正向调控、细胞因子产生的调节、白细胞迁移的调控和细胞因子介导的信号通路等（图3D）。
分析完全缓解状态下的成人与儿童AML患者肿瘤免疫相关基因的差异，与发病期内筛选出的共同DEGs比对后发现，仅白细胞表面抗原CD53（leukocyte surface antigen CD53，CD53）、原癌基因c-Rel（proto-oncogene c-Rel，REL）、趋化因子配体2（C-X-C motif chemokine ligand2，CXCL2）这3个基因相同，发病期间成人与儿童之间的DEGs绝大部分在病情完全缓解后表达不再呈现差异（表1）。说明成人与儿童骨髓中的肿瘤免疫相关基因在AML发病过程中表达的差异多数与疾病有关，以成人和儿童分组来分析AML患者的DEGs具有生物学意义。
2.4影响AML患者总体生存期的基因筛选
为了探索DEGs与患者预后的相关性，使用Kaplan-Meier法分析DEGs的mRNA表达量对AML患者总体生存
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2021,41（5）
上海交通大学学报（医学版）期的影响。结果显示在成人AML 患者骨髓中上调的DEGs 中，IL2RA 和FLT3基因高表达组患者的总体生存期显著缩短（图4）；下调的DEGs 均对患者总体生存期无显著影响。2.5
PPI 网络与关键模块筛选
使用在线数据库STRING 分析39个共同上调DEGs 对
应的蛋白之间的相互作用，通过Cytoscape 3.8.0软件进行可视化分析（图5A ），采用Cytoscape 的CytoHubba 插件筛选连接度最高的18个主要蛋白分子，包含IL2RA 、FLT3、C3AR1、趋化因子和黏附因子等（图5B ）。分别用Cytoscape 的MCODE 与 在线工具对PPI 网络进行密集度分析，得出最显著模块均是以C3AR1为中心的调控网络（图5C ）
。
Note ：A.The mRNA expression heatmap of immune genes in the young and middle-aged group and the children group.B.The mRNA expression heatmap of immune genes
in the elders group and the children group.Orange and red representing the up-regulated genes,blue representing the down-regulated genes,and shades of the color representing the degrees of change
in the expression.
图1不同年龄分组的AML 患者肿瘤免疫相关基因表达的热图分析
Fig 1Heatmap analysis of tumor immune-related genes expression in the AML patients of different age groups
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李玲玲，等成人与儿童急性髓系白血病患者肿瘤免疫相关的差异表达基因分析
Note ：A.DEG analysis of the young and middle-aged group and the children group.B.DEG analysis
of the elders group and the children group.C.DEG analysis of the young and middle-aged group and the elders group.
图2不同年龄分组的AML 患者肿瘤免疫相关基因的火山图分析
Fig 2Volcano map analysis of tumor immune-related genes in the AML patients of different age
groups
Note ：A.Thirty-nine up-regulated DEGs in both the elders group and the young and middle-aged group when compared to the children group.B.Up-regulated DEGs (n =39)mapped to the GO,Reactome and KEGG biological processes and pathways.C.Eighteen down-regulated DEGs in both the elders group and the young and middle-aged group when compared to the children group.D.Down-regulated DEGs (n =18)mapped to the GO,Reactome and KEGG biological processes and pathways.图3不同年龄分组的AML 患者肿瘤免疫相关DEGs 的韦恩图与富集分析
Fig 3Venn map and enrichment analysis of tumor immune-related DEGs in the AML patients of different age groups
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