罗楚平;张婧;季冬淳;陈树桥;陈永兴;赵玉萍;李相前
【摘 要】[目的]建立一种从枯草芽胞杆菌中高效快速制备4种脂肽类抗生素的方法,初步阐明制备脂肽类抗生素的生物学活性.[方法]通过构建脂肽类抗生素突变株,采用酸沉淀、有机溶剂抽提和固相萃取的方法从枯草芽胞杆菌Bs916及其突变株的发酵液中提纯表面活性素、杆菌零素L、泛革素和罗克霉素4种脂肽类抗生素;运用HPLC-MS、SDS-PAGE电泳对制备脂肽类抗生素的纯度进行检测;最后采用西瓜枯萎病菌、金黄葡萄球菌和绵羊血红细胞测定4种脂肽类抗生素的抗真菌、抗细菌和溶血活性.[结果]蛋白凝胶电泳和液相谱联用质谱检测结果表明,制备的脂肽类抗生素均达到了电泳纯和谱纯;生物活性分析实验结果表明,表面活性素和杆菌霉素L具有较强的溶血活性,泛革素和罗克霉素的溶血活性较弱,杆菌霉素L和泛革素具有较强的抗真菌活性,而表面活性素和罗克霉素具有较强的抗细菌活性.[结论]建立快速从芽胞杆菌中提纯4种脂肽类抗生素谱方法,测定了4种脂肽类化合物的生物活性,为进一步探究脂肽类抗生素的构效关系、生物合成和开发应用奠定基础.
网趣电影【期刊名称】《西南农业学报》
【年(卷),期】2018(031)011
国内生产总值平减指数【总页数】8页(P2307-2314)
【关键词】表面活性素;杆菌霉素L;泛革素;罗克霉素;分离纯化;生物活性
【作 者】罗楚平;张婧;季冬淳;陈树桥;陈永兴;赵玉萍;李相前
廉洁修身论文【作者单位】淮阴工学院生命科学与食品工程学院,江苏淮安223002;淮阴工学院生命科学与食品工程学院,江苏淮安223002;淮阴工学院商学院,江苏淮安223002;江苏省南京市水产科学研究所,江苏南京210036;淮阴工学院生命科学与食品工程学院,江苏淮安223002;淮阴工学院生命科学与食品工程学院,江苏淮安223002;淮阴工学院生命科学与食品工程学院,江苏淮安223002尼龙套管
【正文语种】中 文
【中图分类】Q93
【研究意义】脂肽类抗生物素是由短肽头部和脂肪酸尾巴组成的杂合抗生素，由于其理化
性质较为稳定，具有广谱的抗菌、抗病毒［1－4］、抗肿瘤和免疫调节活性［5］，在生物技术和生物制药领域都具有广泛的应用前景。【前人研究进展】枯草芽孢杆菌及其近缘物种解淀粉芽孢杆菌都是脂肽类抗生素合成的重要微生物菌株［6］，目前报道它们能够合成分泌几十种不同结构的脂肽类抗生素，分属于表面活性素、伊枯草素、泛革素和最近发现的罗克霉素四大家簇。枯草芽胞杆菌［7］产生的脂肽类抗生素也具有丰富多样的生物活性，如表面活性素(Surfactin)不仅是表面活性剂，还具有抗癌和抗病毒的作用［8］;泛革素和杆菌霉素具有强抗真菌活性［9］;本团队最近发现的罗克霉素［10］具有强的抗细菌和抗病毒活性［11］。Zeriouh等研究表明脂肽类化合物中主要由iturins和fengycins对病原真菌起抑制作用，而surfactins有明显的抑制细菌效果［12－17］。通常一株优秀芽孢杆菌菌株能同时分泌2～3种脂肽类抗生素。在国内关于脂肽类抗生素的研究进展中，王帅等［12］发现枯草芽孢杆菌菌株G1能产生surfactin，另有研究表明B2菌株仅产 surfactin同系物、JA菌株产 iturinA同系物等［18－20］。枯草芽孢杆菌模式菌株B.subtilis 916由于sfp基因的突变不能合成脂肽类抗生素，解淀粉芽孢杆菌模式菌株B.amyloliquefaciens FZB42能够同时合成表面活性素、杆菌霉素D和泛革素三大家簇脂肽类抗生素。枯草芽胞杆菌Bs916是能同时高效分泌表面活性素、杆菌霉素L、泛革素和罗克霉素4种脂肽类抗生素的
优良菌株［21］，是一种理想的制备脂肽类抗生素纯品的出发菌株。由于这4种脂肽类抗生素的理化性质相近，采用谱技术［22－25］很难进行有效分离。【本研究切入点】本文旨在建立一种从枯草芽胞杆菌Bs916中高效简洁制备4种脂肽类抗生素的方法，初步探究制备脂肽类抗生素的生物活性。【拟解决的关键问题】建立4种脂肽类抗生素高效快速纯化方法［26－31］，检测产品的纯度，并对制备的纯化物抗真菌、抗细菌和溶血活性进行研究。为以后进一步探究脂肽类抗生素的构效关系、生物合成和开发应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌株与培养基
带有新霉素抗性基因的突变株BSBM(Δbmy)由本实验室之前构建和保存［32］。本实验采用的培养基均为LB培养基。LB培养基的配方如下:胰化蛋白胨(Tryptone)10 g/L，酵母提取物(Yeast extract)5 g/L氯化钠(NaCl)10 g/L，另外用NaOH调节该培养基的pH值至7.4。
1.2 4种脂肽类抗生素突变菌株
带有氯霉素抗性基因的泛革素操纵子(fen)突变株构建过程如下:以 FenAF(5'-TTTCTCGAG球
GTCTTGATGGTGCAGTCAGA-3')和FenAR(5'-TTTGAATTCCTGGACCTGTTTGTCTTTGT-3')作为引物，以Bs916的基因组DNA作为模板，PCR扩增到一条长729 bp的片段;扩增的片段经过XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切克隆至质粒载体pSG1164，构建整合质粒载体pSGFen;然后pSGFen转化至芽胞杆菌Bs916，筛选突变株BSFM(Δfen)。
带有壮观霉素抗性基因的表面活性素操纵子(srf)突变株的构建过程如下:以SpecF(5'-TTTGGATCCCTGCAGCCCTGGCGAATG-3')和SpecR(5'-TTTGAATTCAGATCCCCCTATGCAAGG-3')作为引物，以 pDG1728质粒作为模板，PCR扩增到一条长1182 bp的含有壮观霉素表达盒的片段;表达盒经Bam H I和EcoRⅠ双酶切后克隆至pUC19载体，构建为重组载体pUCSC;以SrfA-AF(5'-TTTAAGCTTACACAGATATCAGGCAAGC-3')和SrfA-AR(5'-TTTGGATCCGTCCCATCGTTCCTTCACA-3')作为引物，以Bs916的基因组DNA作为模板，PCR扩增到一条长908 bp的片段;扩增的片段经过HindⅢ 和Bam HⅠ双酶切后克隆至pUCSC，构建重组整合质粒载体pUCSCSrf;构建重组整合质粒载体pUCSCSrf转化至芽胞杆菌 Bs916，筛选突变株 BSSM( Δsrf)［33］。
科索沃战争1.3 脂肽类抗生素提取纯化
杆菌霉素L和表面活性素的纯化方法。枯草芽胞杆菌Bs916突变株BSFM接种至LB培养基，28℃，180 r/min，培养72 h。培养液离心除去菌体后，加盐酸调pH值至2.8，离心得到酸沉淀，甲醇抽提沉淀，然后过0.22 μM的滤膜得到杆菌霉素L和表面活性素的粗提物［34］。将粗提物用去离子水稀释成含30%甲醇水溶液，调pH值至7.0，然后上样于NH2固相萃取柱，分别用含50%甲醇水溶液，100%甲醇，含0.5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲醇溶液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脱，在1%甲酸甲醇洗脱溶液中含有目标化合物。将含1%甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7.0，氮气吹干浓缩后用去离子水稀释为30%甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱［35］;采用 3 倍柱体积的 50%，60%，70%，80%，90%，100%甲醇水溶液梯度洗脱，其中在60%甲醇水洗脱液中得到杆菌霉素L，在100%的甲醇洗脱液中检测到表面活性素。60%甲醇水洗脱液和100%的甲醇洗脱液氮气吹干浓缩后分别得到杆菌霉素L和表面活性素的纯品。
泛革素的纯化方法。泛革素的提取方法的大体步骤如杆菌霉素L和表面活性素的纯化方法，但有以下两点不同:①泛革素提取纯化的出发菌株为突变株BSSM;②过C18固相萃取柱时，在80%的甲醇洗脱液中发现泛革素，80%的甲醇洗脱液氮气吹干浓缩后泛革素的纯品。
罗克霉素的提取纯化方法。枯草芽胞杆菌Bs916接种至LB培养基，28℃，180 r/min，培养72 h。培养液离心除去菌体后，加盐酸调至pH值至2.8，离心得到酸沉淀，甲醇抽提沉淀，然后过0.22 μM的滤膜得到罗克霉素粗提物。将粗提物采用去离子水稀释为含30%甲醇水溶液，pH值调至7.0，然后上样于NH2固相萃取柱，分别用含50%甲醇水溶液，100%甲醇，含0.5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲醇溶液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脱，在2%甲酸甲醇洗脱溶液中含有目标化合物。将含2%甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7.0，氮气吹干浓缩后用去离子水稀释为30%甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱;采用3倍柱体积的30%，40%，50%，60%，70%，80%甲醇水溶液梯度洗脱，其中在含50%和60%甲醇水洗脱液中得到罗克霉素的提纯物。
1.4 脂肽类抗生素的HPLC-MS(高效液相谱质谱联用)分析
采用HPLC-MS的方法定性定量检测4种脂肽类抗生素纯品。液相谱检测条件都采用C18(5 μm;250 by 4.6 mm;VYDAC 218 TP;VYDAC，Hesperia，CA)柱;流动相为乙腈︰水︰三氟乙酸(80︰20︰0.5 vol/vol for surfactin，50 ︰50 ︰ 0.5 vol/vol for fengycin和60︰40︰0.5 for bacillomycin L);流速均为0.5 mL·min－1;紫外检测波长均为210 nm。罗克霉素
(Locillomycin)的检测条件除检测波长为230 nm，其他检测条件同泛革素的检测条件。采用HPLC-MS的方法测定4种脂肽类抗生素的分子质量，使用的仪器为电喷雾条件为Agilent 6410三重串联四级杆质谱仪，测定条件为毛细管电压32 V、喷雾电压20 kV、毛细管温度320℃。
1.5 脂肽类抗生素的SDS-PAGE电泳分析
Tricine-SDS-PAGE鉴定:Tricine-SDS-PAGE参照 Schagger［36］的方法进行，分离胶浓度为 16.5%，浓缩胶浓度3%，恒压100 V电泳4 h后，以含0.25%的考马斯亮蓝的12%的醋酸进行固定和染。对杆菌霉素L和泛革素的标准分子质量进行测定。
1.6 脂肽类抗生素的抗真菌活性和溶血活性测定
脂肽类化合物纯品抗真菌活性测定。将脂肽类化合物纯品配制成不同浓度的带毒培养基，用无菌水做对照，采用管碟法测定其对病原真菌菌丝生长的抑制作用。每组分10个处理，每处理设3个重复。于28℃培养，每12 h以十字交叉法测量1次菌落直径，取其平均值减去原菌丝块直径，连续测定1周。观察4种脂肽类化合物的纯品对病原真菌的抑制作用。在定
性分析的基础上设定4种脂肽类纯化物对各个供试菌的处理浓度梯度，对具有抑制作用的病原菌进行定量分析，计算菌落抑制率。脂肽类化合物的溶血活性。在含有5% 的新鲜的绵羊血红细胞的琼脂培养基上打孔，每空滴加200 μl 1 mg/mL制备的脂肽类抗生素纯品，37℃培养1～4 d，观察空气周围的溶血透明圈，测定4种脂肽类抗生素的溶血活性。
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