㊃基础研究㊃
高姗，许梦琪，杨宁，刘静，谢晓烨，方岩，田磊，刘建伟，王亚斌，曹丰
摘要：目的 应用凝血酶智能响应型纳米探针，实现颈动脉血栓的体内可视化预测，为血栓形成的早期诊断提供新
策略㊂方法 将超顺磁性氧化铁与凝血酶响应肽及C y 5.5-N -羟基琥珀酰亚胺酯(C y 5.5N H S )共价偶联构建探针㊂检测不同浓度探针(0μg /m l ㊁10μg /m l ㊁20μg /m l ㊁50μg /m l ㊁100μg /m l ㊁200μg /m l )对人脐静脉内皮细胞的毒性㊂近红外荧光成像分析加入不同浓度凝血酶的探针荧光强度(实验组：凝血酶浓度分别为0.5U /m l ㊁1U /m l ㊁10U /m l ㊁50U /m l ；空白对照组为0U /m l ；阴性对照组为50U /m l ，并加入100μg 比伐芦定)
㊂制备小鼠颈动脉血栓模型，并对血栓组和对照组小鼠颈动脉组织切片进行免疫荧光染，以探究探针的凝血酶靶向性㊂结果 不同探针浓度的
细胞存活率比较无统计学差异(P >0.05)㊂不同浓度实验组探针荧光强度分别为空白对照组的17.64㊁34.24㊁
55.01和64.65倍(P <0.01)，阴性对照组与空白对照组探针荧光强度比较无显著差异(P >0.05)㊂血栓组小鼠病变局部凝血酶水平较对照组显著升高㊂结论 本研究成功构建凝血酶智能响应型纳米探针，实现颈动脉血栓的早期精准识别，为血栓形成的可视化预测提供了新策略㊂
D O I :10.3969/j
.i s s n .1009-0126.2021.05.021基金项目：国家自然科学基金(91939303);2019解放军总医院军事医学创新项目(C X 19028
)作者单位:100853北京，解放军总医院第二医学中心心血管内科(高姗，许梦琪，杨宁，王亚斌)，老年医学研究所(刘静，谢晓烨，田磊，刘建伟)，第一医学中心心血管内科(方岩)，第二医学中心(曹丰)
通信作者：曹丰,E m a i l :f e n g
c a o 8828@163.c o m 关键词：纳米技术；凝血酶；磁性纳米粒子；血栓形成；荧光共振能量转移
A p p l i c a t i o n o f t h r o m b i n r e s p o n s i v e n a n o -p r o b e i n d i a g
n o s i s o f a r t e r i a l t h r o m b o t i c d i s e a s e
G a o S h a n ,X u M e n g q i ,Y a n g N i n g ,L i u J i n g ,X i e X i a o y e ,F a n g Y
a n ,T i a n L e i ,L i u J i a n w e i ,W a n g Y a
b i n ,C a o F e n g
(D e p a r t m e n t o f C a r d i o l o g y ,C h i n e s e P L A G e n e r a l H o s p i t a l N o .2M e d i c a l C e n t e r ,B e i j i n g 1
00853,C h i n a )A b s t r a c t :O b j
e c t i v e T o r e a l i z e t h e i n v i v o v i s u a l p r e d i c t i o n o
f c a r o t i d t h r o m b o s i s w i t h a t h r o m b i n r e s p o n s i v e n a n o -p r o b e i n o r d e r t o p r o v i d e a n o v e l s t r a t e
g y f o r t
h e e a r l y d
i a g n o s i s o f a r t e r y
t h r o m -b o s i s .M e t h o d s T h e S P I O w a s c o v a l e n t l y c o n j u g a t e d w i t h T r p a n d C y
5.5N H S t o c o n s t r u c t t h e p r o b e .T h e c y t o t o x i c i t y o f t h e p r o b e w a s d e t e c t e d w i t h h u m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h l i a l c e l l a t d i f -f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s (0μg /m l ,10μg /m l ,20μg /m l ,50μg /m l ,100μg /m l ,200μg
/m l ).N e a r -i n -f r a r e d f l u o r e s c e n c e i m a g i n g w a s u s e d t o e x p l o r e t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o f p r o b e s w i t h v a r i o u s t h r o m b i n c o n c e n t r a t i o n s (0.5U /m l ,1U /m l ,10U /m l ,50U /m l r e s p e c t i v e l y ,b l a n k c o n t r o l g r o u p
w i t h a t h r o m b i n c o n c e n t r a t i o n o f 0U /m l a n d n e g a t i v e c o n t r o l g r o u p w
i t h a t h r o m b i n c o n c e n t r a -t i o n o f 50U /m l i n t o w h i c h 100μg b i v a l i r u d i n w a s a d d e d ).M i c e w e r e d i v i d e d i n t o c o n t r o l o r t h r o m b o s i s g r o u p .A c a r o t i d t h r o m b o s i s m o d e l o f m i c e i n t h r o m b o s i s g r o u p w
a s e s t a
b l i s h e d .S e
c -t i o n s o f c a r o t i
齿槽转矩d a r t
丁香小慧e r y s a m p l e s w e r e s t a i n e d w i t h i mm u n o
f l u o r e s c e n c e t o a n a l y
z e t h e t h r o m b i n -t a r g e t e d f e a t u r e o f t h e p r o b e .R e s u l t s N o s i g
n i f i c a n t d i f f e r e n c e w a s d e t e c t e d i n c e l l s u r v i v a l r a t e a t d i f f e r e n t p r o b e c o n c e n t r a t i o n s (P >0.05).T h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o f t h e p r o b e a t d i f f e r e n t t h r o m b i n c o n c e n t r a t i o n s w a s 17.64-f o l d ,34.24-f o l d ,55.01-f o l d a n d 64.65-f o l d h i g
h e r t h a n i n b l a n k c o n t r o l g r o u p (P <0.01).H o w e v e r ,t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n n e g
a t i v e c o n t r o l g r o u p a n d
b l a n k
c o n t r o l g r o u p (P >0.05).T h e s e r u m t h r o m b i n l e v e l w a s s i g n i f i c a n t l y
㊃
725㊃中华老年心脑血管病杂志2021年5月第23卷第5期 C h i n J G e r i a t r H e a r t B r a i n V e s s e l D i s ,M a y 2
021,V o l 23,N o .5
h i g h e r i n t h r o m b o s i s g r o u p t h a n i n c o n t r o l g r o u p.C o n c l u s i o n T h e t h r o m b i n r e s p o n s i v e p r o b e s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e d i n t h i s s t u d y c a n r e a l i z e t h e e a r l y d i a g n o s i s o f c a r o t i d t h r o m b o s i s a c c u-r a t e l y,a n d c a n t h u s p r o v i d e a n o v e l s t r a t e g y f o r t h e i n v i v o v i s u a l p r e d i c t i o n o f a r t e r i a l t h r o m b o s i s. K e y w o r d s:n a n o t e c h n o l o g y;t h r o m b i n;m a g n e t i t e n a n o p a r t i c l e s;t h r o m b o s i s;f l u o r e s c e n c e r e s o-n a n c e e n e r g y t r a n s f e r
动脉血栓形成作为心血管疾病的一种重要病理
改变，常导致严重的并发症，这类疾病往往具有症状
隐匿㊁瞬间突发的特点，是全球疾病和死亡的主要原
因之一[1]㊂目前临床上难以实现血栓的早期精准诊断，近年来有研究者通过分子影像技术监测血栓形
成分子标志物的动态变化来反映疾病的进展过程,
这为血栓性疾病的早期预警和及时靶向提供了
新的思路[2-3]㊂血栓形成通常是由不稳定的动脉斑块破裂所引发的凝血级联反应，凝血酶在此过程中发挥着重要作用[4-5]㊂有研究设计了一种可自动调节凝血的贴片式凝血酶响应补丁，其中凝血酶响应肽(T r p)可以被活化的凝血酶特异性识别并切割，实现特异性激活反应[6]㊂有研究将C y5.5通过基质金属蛋白酶9底物肽与超顺磁性氧化铁(S P I O)连接，建立荧光共振能量转移(F R E T)系统来实现对肿瘤微环境中p H值的智能检测[7]㊂本研究拟应用靶向凝血酶的智能响应型纳米探针，实现对颈动脉血栓的早期诊断，以期为血栓形成的可视化预测提供新策略㊂
1材料与方法
1.1细胞及动物和主要试剂雄性C57B L/6J小鼠,6~8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司㊂T r p购自上海楚肽生物科技有限公司, C y5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯(C y5.5N H S)购自上海金畔生物科技有限公司；人脐静脉内皮细胞(HU V E C)系及完全培养液购自武汉普诺赛生命科技有限公司，胰酶
细胞消化液购自B i o s h a r p公司, C C K-8试剂盒购自德国S i g m a-A l d r i c h公司㊂H u-m a nα-T h r o m b i n(F a c t o rⅡa)购自上海翊圣生物科技有限公司㊂
1.2S P I O-T r p-C y5.5N H S的制备和表征将2 mm o l乙酰丙酮铁㊁1mm o l乙酰丙酮锰和10mm o l 1,2-十六烷二醇混匀，加入3mm o l油酸㊁3mm o l 油胺㊁10m l二苄醚，通入氩气，在磁力搅拌下缓慢加热至200ħ，保温2h，加热至300ħ回流30m i n㊂冷却至室温后，在反应产物中加入40m l无水乙醇后离心(8000r/m i n,10m i n)得到棕黑沉淀物，除去滤液，向沉淀中加入0.05m l油酸和0.05m l油胺，并用正己烷溶解分散㊂将S P I O旋干，称取5 m g溶于适量四氢呋喃，加入6m g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和12m g N H S混匀后加入50m g T r p充分反应，将产物透析3d，冷冻干燥4ħ保存㊂称取S P I O-T r p10m g加入400μl C y5.5 N H S混匀后避光反应过夜㊂将反应液透析24h后冻干保存㊂
将S P I O粉末溶于超纯水(1m g/m l)，适量滴于样品台，晾干后喷金，扫描电镜观察其形态㊂将S P I O悬液滴入激光动态光散射样品池，用690n m 激光连续检测3m i n，将测得粒径用N a n o B o o k90 P l u s P a r t i c l e S i z e A n a l y z e r分析后得到不同悬液的粒径分布曲线；将稀释后的S P I O及S P I O-T r p置于紫外分光光度计检测紫外吸光度值(A值)㊂1.3S P I O-T r p-C y5.5N H S的细胞毒性检测取适量处于对数生长期的HU V E C，弃去培养液，用P B S缓冲液洗涤3次，向培养瓶中加入0.25%胰酶细胞消化液，置于37ħ恒温孵育箱中孵育2m i n，终止消化,1200r/m i n，离心5m i n，弃上清收集
细胞沉淀；重悬细胞，并进行细胞计数，调整为5ˑ104/m l㊂
向96孔板的各孔中加入100μl混匀的细胞悬液，待细胞贴壁后，将其置于37ħ,5%C O2的恒温培养箱中孵育24h㊂24h后弃去培养液，用P B S洗涤3次，并加入100μl经培养液稀释至不同浓度(10㊁20㊁50㊁100㊁200μg/m l)的探针溶液，空白对照组加入100μl培养液，探针浓度为0μg/m l，每组设置5个复孔，继续置于37ħ恒温培养箱中孵育24 h㊂24h后弃去探针溶液，用P B S洗涤3次，并加入100μl培养液和10μl C C K-8溶液，孵育2h后测定450n m处的A值，计算细胞存活率㊂
1.4外源性凝血酶作用下S P I O-T r p-C y5.5N H S 的荧光强度检测向96孔板各孔中加入50μl探针溶液，再加入50μl不同浓度的凝血酶溶液，空白对照组浓度为0U/m l㊁实验组分别为0.5㊁1㊁10㊁50 U/m l，并设置阴性对照组(凝血酶浓度50U/m l，比伐芦定100μg)，每组设置5个复孔㊂在加入凝血酶后40m i n应用I V I S S p e c t r u m成像系统检测，观察各组探针荧光强度，并进行定量分析，比较不同浓度凝血酶作用下探针荧光强度的差异㊂
㊃825㊃中华老年心脑血管病杂志2021年5月第23卷第5期 C h i n J G e r i a t r H e a r t B r a i n V e s s e l D i s,M a y2021,V o l23,N o.5
1.5 S P I O -T r p -C y
5.5N H S 凝血酶靶向性的组织学验证 将C 57B L /6小鼠随机分为对照组(
未造模)和血栓组(颈动脉血栓模型)，麻醉后颈部脱毛，碘伏消毒；沿颈部正中剪一小口，分离左颈动脉；用含10%氯化铁溶液的小滤纸片包裹一段颈动脉，化学损伤诱导血栓形成㊂2组小鼠完成探针注射10
m i n 后，将其安乐死，分离颈动脉,O C T 包埋,
冷冻切片，免疫荧光染标记凝血酶(一抗:R a b b i t g o a t
a n t i -m o u s e t h r o m
b i n a n t i b o d y
,1︰1000；二抗:R a b b i t A n t i -G o a t I g
G H&L (T R I T C ),1︰200),D A P I 溶液(10μg
/m l )染核，用共聚焦显微镜观察㊂1.6 统计学方法 应用G r a p
h P a d P r i s m 9软件分析㊂计量资料以 x ʃs 表示，采用t 检验㊁O n e -w a y解放军理工大学气象学院
A N O V A 分析,P <0.05为差异有统计学意义㊂
2 结 果
2.1 S P I O -T r p -C y
5.5N H S 的理化性质表征 纳米颗粒呈规则球形，粒径均一，没有出现团聚现象,
平均粒径为9.8n m ，多分散系数为0.124,Z e t a 电
位为-9.84m V (图1)㊂S P I O -T r p 在291n m 波长处出现了特征性吸收峰(图2
)
㊂图1
扫描电镜图片和动态光散射粒径分析
图2 紫外吸收光谱
2.2 S P I O -T r p -C y
5.5N H S 的细胞毒性 不同浓度探针与细胞共孵育后，细胞存活率分别为(103.77ʃ
3.00)%㊁(102.40ʃ7.71)%㊁(103.25ʃ6.12)%㊁(9
4.71ʃ3.83)%和(101.39ʃ
5.37)%,
空白对照组为100%，差异无统计学意义(P >0.05)，表明探针溶液浓度在0~200μg
/m l 时，细胞毒性低，安全性较好㊂
2.3 S P I O -T r p -C y
5.5N H S 荧光强度与凝血酶浓度关系 实验组凝血酶浓度为0.5U /m l ㊁1U /m l
㊁10U /m l ㊁50U /m l 的探针荧光强度分别为空白对
照组的17.64㊁34.24㊁55.01和64.65倍，差异均有统计学意义(P <0.01)；阴性对照组的探针荧光强度为空白对照组的0.86倍(P >0.05,
图3)
㊂ 注：与空白对照组比较,a
P <0.01；实验组1=0.5U /m l
；实验组2=1U /m l ；实验组3=10U /m l ；实验组4=50U /m l
图3 S P I O -T r p -C y
5.5N H S 荧光强度与凝血酶浓度关系2.4 组织学验证 免疫荧光染观察到血栓组小
鼠病变部位出现大量凝血酶，且在凝血酶浓集部位可以观察到C y
5.5N H S 的沉积，对照组中上述现象不明显(图4~7
)
㊂ 图4 对照组凝血酶 图5 对照组融合图像 图6 血栓组凝血酶 图7 血栓组融合图像 图4~7 小鼠颈动脉
免疫荧光染
ˑ20
㊃
925㊃中华老年心脑血管病杂志2021年5月第23卷第5期 C h i n J G e r i a t r H e a r t B r a i n V e s s e l D i s ,M a y 2
021,V o l 23,N o .5
3讨论
动脉血栓形成是导致致死性心血管事件的重要
病理改变，对血栓形成的早期预警是降低心血管事
件病死率的关键，但目前仍缺乏血栓性疾病的早期
预警方法，凝血筛查仅用于低风险人，不能准确区
分血栓风险㊁已形成血栓和生理或病理原因导致的
高凝状态；临床常用的影像学方法也无法通过监测
血栓分子标志物的变化实现对血栓的早期预警㊂分
子影像学成为了近年来心血管领域的研究热点，将
血栓发生发展过程中表达发生变化的多种膜蛋白或
分泌型蛋白作为靶点构建靶向纳米探针[8]㊂通过荧光㊁磁共振成像和正电子发射计算机断层显像等多
模态成像方式示踪分子标志物，实现了对血栓形成
的精准可视化预测；同时，可以根据靶标分子的特性
及成像的要求灵活地选择纳米材料，这在极大程度
上解决了传统成像方式存在的空间分辨率低㊁灵敏
度不足的问题[9]㊂
本研究以凝血酶为靶点，利用可被活化的凝血
酶特异性识别并发生切割反应的T r p，构建出一种靶向凝血酶的智能响应型纳米探针；通过测定加入不同浓度外源性凝血酶的探针荧光强度证实，随着凝血酶浓度的升高，探针的荧光强度逐渐增强，在阴性对照组(凝血酶浓度为50U/m l并加入直接凝血酶抑制剂比伐芦定)未观察到探针荧光信号的增强，进一步证实了凝血酶活性与探针荧光强度的关系, F R E T是该类智能响应型荧光探针的基本原理[10]㊂本研究中S P I O-T r p-C y5.5N H S纳米探针的智能响应也是基于F R E T原理实现的，在S P I O与C y5.5 N H S的距离足够近(ɤ10n m)时,C y5.5N H S发出的荧光被S P I O淬灭( 关闭 状态), 开启 状态是通过靶标诱导的F R E T抑制来实现的[11]㊂由于T r p能被活化的凝血酶特异性识别并发生切割反应，使处于连接状态的C y5.5N H S被释放,S P I O 与C y5.5N H S的距离增加，实现了F R E T抑制作用，因而S P I O对C y5.5N H S的荧光淬灭作用消失，可观察到荧光信号增强㊂
本研究中应用10%氯化铁化学损伤的方法成功制备了小鼠颈动脉血栓模型[12]㊂血栓组小鼠的病变部位出现了凝血酶浓集的微环境，并且有C y5.5 N H S在血栓部位的沉积，进一步证实该探针能够精准地靶向凝血酶和血栓形成区域，因此，该探针有望应用于以局部凝血酶浓度激增为分子特征的动脉血栓性疾病的早期㊁精准识别，弥补目前血栓性疾病的诊断方法在时效性上的不足㊂
下一步计划探究S P I O-T r p-C y5.5N H S纳米探针的体内成像效果及凝血酶响应性；其次，完善组织病理学分析明确S P I O-T r p-C y5.5N H S的代谢途径和生物相容性㊂
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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(收稿日期:2021-02-07)
(本文编辑：顾菊芳)
法律关系本座说
㊃035㊃中华老年心脑血管病杂志2021年5月第23卷第5期 C h i n J G e r i a t r H e a r t B r a i n V e s s e l D i s,M a y2021,V o l23,N o.5
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