徐雷锋
摘要百合具有很高的观赏价值，是世界著名的切花之一。本文从百合ＤＮＡ分子标记及其初步应用、转基因和百合基因克隆等3方面综述了国内外在百合分子物学方面所取得的研究进展，并对分子生物学在百合应用上存在的问题与前景进行了讨论。 扇形统计图教学设计
关键词百合DNA分子标记基因克隆转基因分子生物学
Advance in Study on Lilium Molecular Biology
高甘油三酯血症Abstract Lilium has high ornamental value, is one of world famous cut-flowers. A review was given in this paper with advance in study on Lilium molecular biology , such as DNA molecular marker ,gene cloning gene engineering. The questions and prospect of molecular biology research on Lilium were also discussed．
航空摄影测量Key words Lilium DNA molecular marker gene cloning gene engineering molecular biology
百合(Lilium)是百合科百合属多年生草本球根植物，是世界重要的鲜切花之一，有2 000 余年栽培历史，
具有较高的经济和观赏价值。加强百合育种具有很高的经济效益和社会效益。长期以来其品质的改良都是依赖于传统的遗传育种方法。植物分子生物学的迅速发展，为改良植物品质和性状提供了全新的途径，利用转基因的手段改良百合性状和品质变得切实可行[1]。目前，在百合分子生物学方面的研究主要包括百合DNA分子标记的研究和应用、利用转基因技术育种及百合相关的基因克隆等。
1 百合DNA分子标记
DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。自20 世纪90 年代以后,SRAP、SSR 、ISSR 、RAPD、PCR - RFLP 等DNA分子标记技术得到了迅速发展，在百合上也得到了初步的应用。
1.1 SRAP标记
SRAP (Sequence—related amplified polymorphism，SRAP)是一种基于不同物种甚至个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性的特异扩增标记方法。于晖等利用SRAP 分子标记技术对来源于O、L、A基因组, 但亲本基因型未知的20个百合杂交种进行亲本基因型判断[2]. 陈琼等（2007）利用SRAP标记对不同倍性百合杂交后代进行分析[3]。1.2 PCR - RFL P 标记
PCR - RFL P标记是对PCR 扩增的DNA 片段进行限制性酶切片段长度多态性分析。Haruki 等用20 种
限制性内切酶对9 个百合品种的叶绿体DNA 的rbcl 基因和核DNA的rRNA 基因进行PCR - RFL P 分析，将这些百合分为6 个组[4]。
1.3 SSR标记
SSR(Simple Sequence Repeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)，是一类由几个核苷酸(一般为1~6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列.由于每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列.。EST-SSR标记是一种基于EST的分子标记。杨素丽等根据已知的百合EST ( expressed sequence tags) 序列信息, 首次建立百合EST-SSR标记，利用部分EST-SSR序列, 进一步用这些引物在5个系列13个百合品种进行多态性测试[5]。
1.4 ISSR标记
ISSR(inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz等于1994年在SSR标记基础上发展起来的一种新技术，其基本原理是在SSR的5′或3′端加锚1～4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增[6]。吴学尉等(（2009)使用5对ISSR引物, 对由东方百合优良品种‘Sorbonne’、‘Tiber’和‘Cobra’为亲本的4对杂交组合获得的40个杂交后代指纹进行了分析[7]。
1.5 RAPD 标记
周易论文
RAPD(random amplified polymorphic DNA)是指随机扩增的多态性DNA ，它以一个10 碱基任意序列的寡核苷酸片段引物在未知序列的基因组DNA上进行随机的PCR 扩增。RAPD 标记能灵敏地揭示两个亲缘关系相近的个体之间的遗传变异，可应用于百合分类、居遗传结构分析、基因定位和遗传图谱构建等。1995 年YAMA GISHI M等用RAPD 标记对百合属植物进行了种和种间的鉴定[8]。贾月慧等（2005）利用RAPD 标记对辐射亚洲百合‘pollyanna’雄性不育突变体进行分析[9]。孙晓梅等（2006）应用RAPD 标记对百合杂交种真实性进行了早期鉴定[10]。赵祥云等( 1995) 研究了
利用RAPD 标记评价百合品种间遗传关系, 结果每个品种都得到了各自独特的带谱[11]。另外, 张克中等(2003)利用RAPD 标记对辐射百合雄性不育突变体进行了筛选[12]。Persson(1998)和Wen(1999, 2001)等用RAPD 标记分析了星叶百合和麝香百合居内和居间的遗传变异[13]。Muisers 等(1995)发现了1 个与百合花的寿命基因紧密连锁的RAPD 标记[14]。荷兰的植物育种者开发了RAPD 分子标记系统, 到了与镰刀菌抗性基因连锁的RAPD 分子标记, 并构建百合的遗传图谱(Tuyl, 1996) [15]。Lee(1993)应用RAPD 技术对百合对韩国的百合进行了分组[16]。罗凤霞等(2008)应用RA PD 分子标记方法对包括丹东百合在内的13 种百合种质资源进行了亲缘关系分析[17]。童巧珍等（2010）利用RAPD标记对江苏、江西、广西、湖南、甘肃5省采集16 个百合种质资源进行了亲缘关系分析[18]。
2 百合分子育种中外源基因的研究现状
随着分子生物学的发展，利用基因工程手段对花卉进行改良育种在近十几年也得到了迅速的发展。百合的基因工程起步较晚，早期的研究主要是建立有效的百合再生体系和探讨遗传转化中的各种因素对转化的影响，转入的基因主要是NPTⅡ和GUS报告基因。后期则以通过农杆菌介导、基因法、花粉管通道法等转化方法将目的基因导入百合，旨在通过对百合定向改良性状的研究，拓展百合新品种。在百合遗传转化研究中导入的外源基因见表1 表1百合遗传转化研究中导入的外源基因
基因功能导入百合的基因
报告基因GUS，NPTⅡ
花基因Hf 1 Hf2
抗虫Pta
抗病毒无毒cmv复制酶基因PAP LSV CP
抗非生物胁迫DREB PAT Mn-SOD 基因S6 PDH
雄性不育基因rol A，B，C基因
抗细菌NP-1
抗真菌Chi Glu
衰老相关基因PeACC LA CO 反义基因A CC合酶基因
2.1 百合抗病毒转基因研究
百合生长过程中常遭受病毒的浸染。自stewart1986年描述百合的坏死条纹病毒以来，国内外文献已报道侵染百合的病毒有19种。其中危害最为严重的主要病毒有4种。即百合无症病毒，黄瓜花叶病毒、郁金香碎锦病毒和百合从簇病毒。抗病毒基因工程可以从根本上减轻病毒病的危害，开辟了植物抗病育种的新途径。Pham等将LSv外壳蛋白基因利用基因法转入‘雪皇后’(Snow Queen)的愈伤组织，以GUS和磷酸转移酶为报告基因和选择标记，愈伤组织诱导分化得到LSV抗性植株[19]。徐品三通过克隆Lsv外壳蛋白基因，利用Gateway技术成功构建RNA i载体，并用于农杆菌介导的百合转化，从而试图达到抗LSV的目的，这是百合抗病毒研究在分子水平的一个新的尝试[20]。短路容量
王进忠等（2005）：以麝香百合叶片愈伤组织为受体，利用根瘤农杆菌介导法将美洲商陆蛋白(PAP) 基因转入百合叶片愈伤组织中, ，获得49 株再生植株，经PCR 检测表明PAP 基因已经转移到有抗性愈伤组织再生出百合植株中[21]。
Lipsky A 等利用基因的方法将无毒CMV复制酶基因导入百合鳞茎愈伤组织中，并获得了PCR阳性植株[22]。.
2.2 百合抗虫基因转基因研究
百合的虫害很多，去除百合虫害的方法也很多，但获得绿环保又健康的除虫百合，即培育抗虫百合新品种的研究还得从基因入手。在切花百合的栽培中，虫害是影响百合生产的一个重要问题，其中危害较大的虫害主要有蚜虫、红蜘蛛和几种鳞翅目害虫。目前在植物抗虫基因工程中，已被广泛应用的抗虫基因有苏云金芽孢杆菌基因，植物外源凝集基因，植物蛋白酶抑制剂基因和淀粉酶抑制剂基因等四类。其中植物外源凝集基因在自然界广泛存在，种类很多，它能特异识别可逆结合糖类复合物的糖基部分而不改变被识别糖基的共价结构，是一类非免疫蛋白。唐东芹等将半夏凝集素基因pBIXPTA通过农杆菌导入百合基因组中，分子检测证明已整合到百合基因组中[23]。
2.3 百合抗非生物胁迫转基因研究
低温、干旱、盐碱等不良环境作用于植物，将会引起植物代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至引发不可逆伤害，导致整个植株死亡。提高植物的抗旱、耐盐等抗非生物胁迫能力，已经成为现代植物育种工作亟待解决的关键问题之一。Watad等用基因法以愈伤组织为受体导入基因PAT，经过southern-blot检测，得到3株阳性株[24] 。
张莹莹等（2009）以东方百合为材料，通过农杆菌介导法将DREB 基因转入植株中，通过筛选、检测，获得转DREB
基因植株[25] 。
华智锐等（2010）利用农杆菌介导S6 PDH 基因导入麝香百合的转化植株，获得了抗性增强的植株[26]。
陈莉等以麝香百合为材料，通过农杆菌介导法将Mn-SOD 基因转入植株中，通过筛选、检测，获得转Mn-SOD 基因植株[27] 。
2.4 百合花基因工程研究
花的颜是百合最重要的性状之一，改变花一直是花卉研究最为热门的内容，也是百合转基因中研究最早的方向。目前关于百合花瓣着机理和花与素的关系已被阐明。花主要由类黄酮、类胡萝卜素、生物碱三类物质决定，因此，将类黄酮基因、类胡萝卜素基因等导入百合，使其改变花成为可能。
徐碧玉等（2005）利用RT-PCR技术从矮牵牛的紫花瓣中克隆了两个控制花的类黄酮3’,5’羟基化酶基因Hf 1和Hf 2, 并构建了植物表达载体, 利用农杆菌介导法对铁炮百合进行了遗传转化, 获得了转基
因植株[28]。
2.5 百合抗真菌病及细菌病基因工程
百合的真菌病害种类较多，危害甚广。尽管药剂防治有一定的效果，但往往使以大剂量使为前提的，因而残留较多，培育抗真菌病害的品种显得尤为重要。刘菊华等用携带有几丁质酶基因和β－1，3 葡聚糖酶基因的工程菌，以鳞片叶通过农杆菌介导法和基因转化法转化龙牙百合均得到转基因植株[29]。
在抗病百合基因工程的研究中，也做了一些抗细菌百合的研究工作。李宝平等以百合鳞片为外植体，用叶盘法将兔免疫素NP-1基因导入百合中，并获得了整合目的基因的植株[30]。
2,6 百合保鲜基因工程中国青年创业国际计划
百合与其它鲜切花一样随着花朵的开放而迅速衰老，如何延长百合花朵的保鲜期已成为近二三十年来百合研究的热点。由于常规杂交育种的局限性和化学保鲜剂使用的毒副作用，目前许多专家都把目光投向转基因植物育种的应用上。百合上主要利用RNA或RNAi 技术把百合ACC 合酶基因片段或ACC氧化酶基因片段导入到百合优良品种中一定程度上抑其内源A CC合酶或A CC氧化基因的表达，从而抑制乙烯的生物合成。
张建鑫等（2008）以东方百合‘索邦’无菌苗鳞茎、鳞片叶及愈伤组织为外植体，通过农杆菌介导，将A CO 反义基因导入东方百合“索邦”。PCR 法检测证明A CO 反义基因已转入转化植株基因组中[31]。
王燕等以东方百合“索邦”(Sorbonne）的无菌苗为材料，将从牡丹中克隆到的PeACC（ACC 氧化酶）基因片段采用RNA 干扰（dsRNA-mediated gene silencing）技术，利用根癌农杆菌介导法导入百合外植体，通过PCR 检测后获得阳性表达的植株[32]。
刘岚等利用农杆菌介导的方法，将ACC合酶反义基因转化“西伯利亚”中，获得了9株转化植株，经PCR检测其中2株呈阳性[33]。
赵欢蕊等究以亚洲百合‘普利安娜’为试材，农杆菌介导的A CO 基因RNA 干扰表达载体转化亚洲百合，获得转化植株[34]。
李小玲等以亚洲百合‘精粹’无菌苗叶片和小鳞片为材料，将百合A CC 氧化酶（A CO）基因采用RNA 干扰（dsRNA-mediated gene silencing）技术，利用根癌农杆菌介导法导入百合外植体，通过PCR 检测后获得阳性表达的植株[35]。
3 百合相关基因的克隆
通过基因工程改良生物遗传构成的第一步是从特定生物中获取目的基因。近年来，百合的一些优良基
因和相关基因片断已被发现、分离和克隆，这方面研究主要集中通过RT-PCR、RACE、SSH结合RA CE和RLM-RA CE等技术从百合中克隆花发育基因、花粉发育基因、花基因和抗氧化基因等方面（表2）。
表2百合基因的克隆与功能分析
4问题及展望
综上所述，百合分子生物学取得了较快发展。在分子标记、百合相关基因的克隆和转基因方面取得了一定的进展，但百合分子生物学研究目前仍处于起步阶段，各方面仍需要进一步深入研究。
百合DNA分子标记还研究较少，仅局限在SRAP、SSR 、ISSR 、RAPD、PCR - RFL P等标记技术的研究与应用，并且应用也只是局限于百合各品种多态性检测和百合种质资源进行了亲缘关系分析上，很少有应用于定位基因上的报道。今后应对分子标记进一步开发与利用，将其应用于构建遗传图谱和基因的定位上。
百合基因工程随着植物基因工程技术的提高而取得了发展。在百合基因转化受体, 遗传转化体系和外源基因成功整合到百合基因组方面已有诸多报道。但由于目前百合基因工程尚处于起步阶段, 还存在诸如遗传转化效率较低，获得目的基因成功表达的植株的报道较少, 稳定表达基因大多仅限于报告基因, 且大多数材料只是获得基因瞬时表达。在百合基因工程研究中，如何克隆出更多目的基因，提高转化效率，建立高效、稳定的无基因型依赖性的转化系统，还需大量的研究[60]。通过基因工程得到的只是一种人工种质新材料，而不是生产上可以立即应用的新品种，它必须通过育种程序的深入研究，与常规育种紧密结合，经过大田试验将外源基因稳定持续的遗传给后代，才可能最终取得经济效益和社会效益[61]。所以将基因工程育种和传统育种相结合才是百合育种的长期战略。
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