成功地将抗虫Bt基因与蛋白酶抑制剂基因导入云杉中,有效地防止了卷叶蛾的危害。1994年KleinerK.Wdawson cd等人获得抗枯叶蛾毛虫和吉卜赛蛾的转基因杨(NC5339)无性系。同年ShinD.I等将Bt基因转入欧洲落叶松,通过Southern,Northern和Westernblot分析以及生物测定证明该基因已得到表达。中科院上海植生所和南京林业大学合作,将Bt基因导入毛白杨和美洲黑杨×小叶杨无性系NL-80106。中科院微生物所对Bt基因的5′端和3′端进行改造,构建
了带有双转录的增强子,并植入翻译增强子TMV谢尔宾斯基的Ω片段的中间载体,分别将有四种不同缺失长度的Bt基因载体,即含全长基因3·6kb、2·8kb、2·1kb和1·8kb转入农杆菌LBA4404,并与中国林科院合作转化欧洲黑杨共获得54棵转基因植株,SouthernBlot证明该基因稳定地插入到杨树基因组中,虫试测定表明,其毒杀鳞翅目害虫舞毒蛾和杨尺蠖的能力高达76-100%。后来中国林科院又把上述Bt基因导入欧美杨和美洲黑杨,成功地获得转Bt基因抗叶部害虫植株。WangGejiao等也成功地获得转Bt基因的黑杨植株,经2~3年的抗虫测定和优良性状选择宜为凯姆,有3个无性系即12、153和192在中国6个省种植进行评估。1998年Son-SukGyu等在杨转基因研究时,发现PEHA101载体比LBA4404/PB121效率高达6倍。到目前为止,有表达Bt基因的树种有杨树、苹果、核桃、落叶松、花旗松、火炬松和云杉等。
1.2 蛋白酶抑制剂基因
蛋白酶抑制剂(PI)是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一,存在于所有生命体中。植物中存在三类,它们是丝氨酸蛋白酶抑制剂、疏基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。前者与抗虫关系密切,疏基蛋白酶抑制剂对鞘翅目昆虫具有独特抗性。它们的杀虫机理就在于,它能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用,形成酶—抑制剂复合物(EⅠ),阻断或减弱消化酶的蛋白水
解作用,所以影响外来蛋白的正常消化,同时它刺激消化酶的过量分泌,通过神经系统反馈,使昆虫产生厌食反应,最终造成昆虫的非正常发育或死亡。
目前,已有多种蛋白酶抑制剂基因或cDNA被克隆,并得到一批转基因植株,转基因植株表现出良好的抗虫效果,尤其是丝氨酸类蛋白酶抑制剂中的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CPTⅠ)和马铃薯蛋白酶抑制剂—Ⅱ(PⅠ—Ⅱ)。豇豆胰蛋白酶抑制剂具有广谱抗虫性,纯化的CPTⅠ对鳞翅目、鞘翅目及直翅目的害虫有毒性。1987年英国的Hilder首先获得转CPTⅠ基因烟草植株。刘春明等对鉴定出的转基因植株,用2—3龄的棉铃虫进行抗虫测试,4天后死亡率达50%,存活的虫生长发育也明显受到了抑制。中科院遗传所对CPTⅠ基因转化杨树,也获得成功。在随后几年中,美国、英国和中国研究人员相继把CPTⅠ基因转入一些重要的经济植物中,包括苹果和杨树。PⅠ—Ⅱ是一类损伤诱导型表达的基因产物,主要成分是丝氨酸蛋白酶抑制剂。1988年美国依阿华大学林学系在林木方面首先利用PⅠ—Ⅱ基因,以根癌农杆菌Ti质粒为载体对杨树无性系NL5339进行转化,获得卡那霉素植株。
蛋白酶抑制剂基因在抗性基因工程中突出的优点是抗虫谱广,对几个目的昆虫均有毒性作用,而Bt基因抗虫谱却十分有限李健吾;其次,它来自植物本身,比来源于细菌的转基因产品更易于被公众接受。问题在于,基因表达量还远远达不到要求,这给基因工程带来一定的难度。
1.3 其它
淀粉酶抑制剂(aAl)、外源凝集素(Lectin)、几丁质酶(Chitinase)、核糖体失活蛋白(RIP)等基因也是丰富的抗虫基因,在基因工程中发挥作用。ALtabella等把菜豆aAl编码和种子特异性表达的蚕豆植物血凝素基因及其调控区融合在一起,插入到Ti质粒表达载体中转化烟草,发现aAl基因能稳定地表达。在Lectin基因转化方面,Maddock(1990)用基因转化玉米胚性悬浮细胞系获得成功,转化的植株对欧洲玉米螟具良好的抗性。此外还成功地将豌豆外源凝集素基因导入烟草和马铃薯,抗蚜虫效果明显。目前,在林木方向未见报道。应当指出,这些工作刚刚开始不久,获得的转基因植株是否对人、畜无害还有待进一步证实。
2抗虫转基因植物的研究前景
基因工程为林木抗病虫开辟了一条诱人的新的育种途径。林木生长周期长,用常规育种方法不仅时间长,见效慢,而且可操作性差。应用基因工程进行林木抗病虫育种有其显著的优越性,它可以大大地缩短育种周期,中国工程物理研究院又可在基因水平上改造林木抗性遗传物质,更具科学性和精确性,提高了育种的目的性和可操作性。此外,还大大地扩大了育种的范围,打破物种之间的生殖障碍,实现基因的共同性。所以,只要我们面对存在的问题,加大研究投入,并有效地与常
规的林业技术措施相配合,必将会培育出更多有价值的抗病虫基因工程树木。
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