1.氨基酸分析方法通则的说明
编号JY/T 019—1996
名称(中文) 氨基酸分析方法通则
(英文) General rules for amino acid analysis
叛逆性骚扰
归口单位国家教育委员会
起草单位国家教育委员会
主要起草人李 聪 刘子列
批准日期 1997年1月22日
实施日期 1997年4月1日
替代规程号无
适用范围本方法适用于异硫氰酸苯酯柱前衍生法定性、定量测定样品中水解氨基酸、游离氨基酸以及不常见的氨基酸。 主要技术要求 1.
定义
2. 方法原理
3. 试剂和材料
4. 仪器
5. 样品
6. 分析步骤
7. 分析结果的表述
是否分级无
检定周期(年)
附录数目无
出版单位科学技术文献出版社
检定用标准物质
相关技术文件
备注
2.氨基酸分析方法通则的摘要
pgl2008本方法适用于异硫氰酸苯酯柱前衍生法定性、定量测定样品中水解氨基酸、游离氨基酸以及不常见的氨基酸。
2 定义
2.1 氨基酸 Amino acid
分子内含氨基(亚氨基)和羧基的有机物化合物的总称。根据氨基(亚氨基)与羧基相对位置的不同，分为α-，β-，γ-，δ-，ω-氨基酸。α-氨基酸是组成蛋白质的基本单位。常规的氨基酸分析主要指蛋白质水
解氨基酸，游离氨基酸的分离测定。
2.2 柱前衍生 Pre-column derivatization
为了提高氨基酸分析的检测灵敏度和分离选择特性，通常采用使氨基酸衍生化的方法。柱前衍生法，即样品在用分析柱分离前进行衍生化反应，然后经谱柱对衍生物进行分离。
2.3 梯度洗脱 Gradient elution
间断地或连续地改变流动相组成或其它操作条件，从而改变谱洗脱能力的过程。 2.4 基线Baseline
缓冲垫
在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的响应信号曲线。基线反映仪器的噪音随时间的变化。
2.5 谱峰 Chromatographic peak
谱柱流出组分通过检测系统时，所产生的响应信号对时间作图所得的曲线，曲线的突起部分称为谱峰。
2.6 峰面积 Peak area
谱峰所包括的面积。
2.7 保留时间 Retention time
从进样开始到某个组分的谱峰出现，最大值的时间间隔称为该组分的保留时间，用t R 表示。
漂亮女人电影下载2.8 标准样品Standard sample
作为定性及定量鉴定用的纯物质。PICO-TAG TM氨基酸分析使用的是美国PIERCE生产的按一定比例混合配制而成的17种水解氨基酸标准液和38种游离氨基酸标准液。
2.9 标准校正曲线 Standard sample calibration curve
用标准样品配制的一系列不同浓度的标准液上机测试后，经计算绘制的作定量分析的标准曲线。
3 方法原理
采用异硫氰酸苯酯 (PITC) 作为柱前衍生剂。PITC 与氨基酸分子中的氨基(亚氨基)发生定量的衍生化反应，产生苯基硫代氨甲酰-氨基酸 (PTC-AA)。过量的PITC通过真空干燥除去。
评剧宋丽衍生产物苯基硫代氨甲酰-氨基酸(PTC-AA)的混合物在谱柱中随流动相作相对移动时，混合氨基酸
衍生物在两相间进行反复多次的分配。因两相间分配系数不同，使混合组分达到分离。
由于PITC试剂与氨基酸发生衍生化反应生成PTC-AA，在氨基酸的结构上引入了苯环，
使氨基酸的极性降低而有利于反相谱分离。苯环的引入同时也使紫外检测器能够高灵敏度地定量检测PTC-AA。PTC-AA结构稳定可在室温下放置数小时或冰箱内放置一周不变质。
以标准混合氨基酸的PITC衍生物PTC-AA绘制标准工作曲线，即可对待测试样中的PTC-AA进行定量分析。
4 试剂和材料
所用试剂除已注明外，均需谱纯或优级纯(相对比例按质量比)。
4.1 水解氨基酸(HAA)测定试剂
4.1.1 流动相
A液：19.0g NaAc.3H2O，0.5ml三乙胺和200μl 0.0％EDTA溶于1000ml超纯水中，用冰醋酸水溶液调pH至6.40后用0.45μ的滤膜过滤。分别取940ml此液与60ml乙腈混合，在真空下超声波脱气20s后，充氮备用。
B液：分别量取600ml乙腈，400ml超纯水和200μl 0.0％EDTA混合后，在真空下超声波脱气20s后备用。
4.1.2 样品水解液：1g苯酚溶解于6mol/L HCl 100ml中或直接加200μl 6mol/L HCl及0.5mg 苯酚(结晶状)于空样品管中备用。
4.1.3 再干燥试剂：乙醇∶水∶三乙胺＝2∶2∶1
4.1.4 衍生试剂：异硫氰酸苯酯∶乙醇∶三乙胺∶水＝1∶7∶1∶1
4.1.5 样品稀释液：取710mg Na2HPO4加超净水溶至1000ml〔用10％磷酸∶乙腈(95∶5)磷酸乙腈液调pH＝7.40备用〕。
4.2 游离氨基酸(FAA)测定试剂
4.2.1 流动相
A液：称取9.54g NaAc·3H2O(或5.75g NaAc)加1000ml超纯水，搅拌至完全溶解(用10％乙酸调pH值至6.50±0.02)。用0.45μ的滤膜过滤。分别取25ml乙腈、250μl 10m mol/L EDTA 和975ml上述配制的溶液充分混合后在真空下超声波脱气20s。
B液：分别取450ml乙腈、150ml甲醇和400ml超纯水，混合均匀，并在真空下超声波脱气30s后备用。
4.2.2 再干燥试剂：甲醇∶1.0mol/L醋酸钠∶三乙胺＝2∶2∶1
4.2.3 衍生试剂：异硫氰酸苯酯∶甲醇∶三乙胺∶水＝1∶7∶1∶1
4.3 不常见氨基酸的测定应根据其结构特点配制不同流动相及试剂进行分析。
5 仪器
5.1 仪器性能必须满足检定规程的要求
5.2.1 装置结构连接图，如图2所示。
A泵 水解衍生工作台
进样器 谱柱 检测器 B泵 温度控制器
谱工作站
图2 氨基酸分析仪连接
5.2.2 仪器装置系统管路连接是确保系统间重现性的关键因素。
5.3 主要装置
5.3.1 温度控制器
控制氨基酸分析柱温箱的温度。
5.3.2 泵
根据仪器需要，须配置两台泵。
5.3.3 进样器
手动进样器、自动进样器均可。
5.3.4 谱柱
蛋白质水解试样选用氨基酸分析柱(HAA)，生理体液试样选用游离氨基酸柱(FAA)。 5.3.5 检测器
选用紫外检测器。
5.3.6 谱工作站
任选WATERS810或820及其他谱工作站。
5.3.7 水解衍生工作台
用于样品的水解、恒温、干燥、抽真空、充氮工作。
6 样品
6.1 样品处理
6.1.1 准备
注：133.3Pa＝1 torr＝1 mmHg
准确称取一定量的样品(蛋白质为0.5μg～10μg)，溶液样品(蛋白、肽)20μl～30μl 最大100μl，放入洗净的样品小管中。
青藤碱6.1.2 干燥
把样品管放入到水解反应瓶中并盖紧瓶盖，将反应瓶安放在水解工作台上并连接真空和纯氮，打开真空旋钮，60mτ～100mτ(8Pa～13Pa)真空干燥20min～30min后，取下反应瓶在瓶底部加入200μl样品水解液。
6.1.3 置换空气
把反应瓶装到水解工作台上，1T～2T(133Pa～266Pa)抽气20s～30s。氮气控制在
0.15kg/cm2，充氮5s左右，反复置换三次，取下反应瓶。
6.2 水解与衍生
将反应瓶放入水解工作台恒温加热器中水解(150℃1h或105℃ 24h)。水解完成后，从恒温加热器中取出反应瓶，将样品管取出放入新反应瓶中，重复6.1.2干燥操作。
6.2.1 再干燥
在样品管中注入10μl再干燥液，涡旋搅拌器搅拌均匀，放入反应瓶中，在水解工作台上60mτ～100mτ(8Pa～13Pa)真空干燥(20min～30min)后取出样品管。
6.2.2 衍生反应
再干燥后的样品管中注入20μl衍生试剂(要求现配，并在2h内使用)，涡旋搅拌器搅拌均匀后放入反应瓶中，并在室温下放置15min，然后在水解工作台上60mτ～100mτ真空干燥，等完全干燥后放置冰箱中待测。
6.2.3 衍生样品溶解
将样品管取出，放入100μl样品稀释液，用涡旋搅拌器混均后待测。
6.3 游离氨基酸不须水解，样品经超滤处理后，直接进行干燥、再干燥、衍生等工作。
7 分析步骤
7.1 打开计算机，按操作程序编辑方法文件、梯度程序、积分参数以及组分表等工作参数。
7.2 开机设定紫外检测器检测λ254nm，柱温38℃。
7.3 用梯度平衡仪器，待基线平稳后，即可进样分析。
7.4 直接用微量进样器吸取已稀释好的试样或将试样装入自动进样器样品瓶内进行分析。
7.5 用水解氨基酸(HAA)或游离氨基酸(FAA)混合标样配制一系列不同浓度的标准液，与待测试样同时
衍生化后进样分析，计算机按所设定的分析参数收集并处理数据。
8 分析结果的表述
8.1 根据分析工作图谱，判断所测17种或38种氨基酸的分离是否正常(具体标准详见附注)。
8.2 根据所测标准样品中各氨基酸的保留时间，对所测未知试样进行定性分析。
8.3 根据所测标准样品中各氨基酸的峰面积的工作曲线与校正因子，对所测未知试样进行定量分析。
8.4 将所得结果换算为质量浓度或质量分数。
注: 需要查阅全文, 请与出版发行单位联系.
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